Stratégie phosphoproteomic pour profiler la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis
Summary
Présenté ici est une approche phosphoproteomic, à savoir arrêter et aller pointe d’extraction à base de phosphoproteomic, qui fournit un haut débit et une couverture profonde du phosphoprotéome Arabidopsis. Cette approche délimite la vue d’ensemble de la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis.
Abstract
La phosphorylation des protéines est cruciale pour la régulation de l’activité enzymatique et de l’expression des gènes dans un état osmotique. La spectrométrie de masse (MS) à base de phosphoproteomics a transformé la façon d’étudier la transduction du signal végétal. Toutefois, l’exigence d’un grand nombre de matériaux de départ et d’un temps de mesure prolongé de la SP pour atteindre la profondeur de la couverture a été le facteur limitant pour l’étude à haut débit des changements phosphoproteomic mondiaux dans les plantes. Afin d’améliorer la sensibilité et le débit de la phosphoproteomics végétale, nous avons mis au point une approche phosphoproteomics à base de pointes d’extraction (étape) couplée à l’étiquetage Tandem Mass Tag (TMT) pour l’analyse rapide et complète de la perturbation de la phosphorylation des plantes en réponse au stress osmotique. Tirant parti de la simplicité et du débit élevé de la technique de pointe de scène, l’ensemble de la procédure prend environ une heure en utilisant deux pointes pour terminer l’enrichissement du phosphopeptide, la fractionnement et les étapes de nettoyage de l’échantillon, ce qui suggère une utilisation facile à utiliser et une grande efficacité de l’approche. Cette approche fournit non seulement une analyse approfondie de la phosphoproteomics végétale (> 11 000 identification au phosphopeptide), mais démontre également l’efficacité supérieure de séparation (< chevauchement de 5 % ) entre les fractions adjacentes. En outre, le multiplexage a été réalisé à l’aide de l’étiquetage TMT pour quantifier les changements phosphoproteomic des plantes mutantes de type sauvage et de snrk2 decuple. Cette approche a été utilisée avec succès pour révéler les événements de phosphorylation des kinases de type Raf en réponse au stress osmotique, qui met en lumière la compréhension de la signalisation osmotique précoce chez les plantes terrestres.
Introduction
La salinité élevée, la basse température et la sécheresse causent des contraintes osmotiques, qui est un facteur environnemental majeur qui affecte la productivitédes plantes 1,2. La phosphorylation des protéines est l’une des modifications post-translationnelles les plus significatives qui médient la perception et la transduction du signal dans la réponse des plantes au stressosmotique 3,4,5. Kinase 2s de protéine SNF1-connexe (SnRK2s) sont impliqués dans le stress osmotique signalant6. Neuf des dix membres de la famille SnRK2 montrent une activation significative en réponse au stressosmotique 7,8. Le snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutant ayant des mutations dans les dix SnRK2 a montré l’hypersensibilité au stress osmotique. Chez le mutant snrk2-dec, l’accumulation osmotique induite par le stress de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3),de la biosynthèse de l’acide abscisique (ABA) et des expressions géniques est fortement réduite, mettant en évidence le rôle vital des SnRK2 dans les réponses osmotiques au stress6. Cependant, on ne sait toujours pas comment les kinases SnRK2s régulent ces processus biologiques. Le profilage des changements phosphoproteomic en réponse au stress osmotique est un moyen efficace de combler cet écart et de délimifier les mécanismes de défense osmotiques déclenchés par le stress chez les plantes.
La spectrométrie de masse (SP) est une technique puissante pour cartographier le phosphoproteomevégétal 9. La caractérisation du phosphoproteomics végétal, cependant, reste un défi dû à la gamme dynamique du protéome végétal et à la complexité du lysatevégétal 4. Pour surmonter ces défis, nous avons développé un flux de travail phosphoproteomic végétal universel, qui élimine les interférences indésirables telles que des pigments photosynthétiques et des métabolites secondaires, et permettant la couverture profonde du phosphoproteomevégétal 10. Plusieurs méthodes d’enrichissement du phosphopeptide telles que la chromatographie d’affinité irationnelle métallique immobilisée (IMAC) et la chromatographie par oxyde métallique (MOC) ont été développées pour enrichir les phosphopeptides avant l’analyse de la SP11,12,13,14,15,16. Les non-phosphopeptides acides co-purifiant avec les phosphopeptides sont les principales interférences pour la détection du phosphopeptide. Auparavant, nous avons normalisé la valeur du pH et la concentration d’acide organique du tampon de chargement IMAC afin d’éliminer la liaison des non-phosphopeptides, afin d’obtenir plus de 90 % de spécificité d’enrichissement en contournant l’étape de pré-fractionnement11.
La perte d’échantillon dans le processus en plusieurs étapes de l’enrichissement et de la fractionnement de phosphopeptide entrave la sensibilité de l’identification de phosphopeptide et la profondeur de la couverture phosphoproteomic. Les pointes d’arrêt et d’extraction (pointes d’étape) sont des bouts de pipette qui contiennent de petits disques pour plafonner l’extrémité de la pointe, qui peuvent être incorporés avec la chromatographie pour la fractionnement de peptide et lenettoyage 17. La perte d’échantillon pendant la procédure de pointe de l’étape peut être réduite au minimum en évitant le transfert d’échantillon entre les tubes. Nous avons mis en œuvre avec succès la pointe de stade dans Ga3+-IMAC et Fe3+-IMAC pour séparer les peptides phosphorylatés multiples abondants bas des peptides phosphorylatés singly, qui ont amélioré la profondeur du phosphoproteomehumain 15. En outre, l’utilisation de la pointe de phase inversée à pH élevé (Hp-RP) a démontré la couverture plus large du protéome de membrane humaine comparée à celle de l’échange fort de cation (SCX) et de la chromatographie forte d’échange d’anion (SAX)18. Par conséquent, l’intégration des techniques de pointe de scène IMAC et Hp-RP peut augmenter la couverture du phosphoprotéome végétal avec simplicité, haute spécificité et débit élevé. Nous avons démontré que cette stratégie a permis d’identifier plus de 20 000 sites de phosphorylation provenant de semis d’Arabidopsis, ce qui représente une profondeur accrue du phosphoprotéomevégétal 19.
Ici, nous rapportons un protocole phosphoproteomic basé sur la pointe de étape pour le profilage phosphoproteomic dans Arabidopsis. Ce flux de travail a été appliqué pour étudier la perturbation phosphoproteomic des semis mutants de type sauvage et de snrk2-dec en réponse au stress osmotique. L’analyse phosphoproteomic a indiqué les emplacements de phosphorylation impliqués dans l’activation de kinase et la signalisation osmotic tôt de stress. L’analyse comparative des données de phosphoproteome mutant de type sauvage et de snrk2-dec a mené à la découverte d’une cascade de kinase raf-like (RAF)-SnRK2 qui joue un rôle clé dans la signalisation de stress d’osmore dans les usines élevées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plage dynamique et la complexité du protéome végétal et du phosphoprotéome sont toujours un facteur limitant à la profondeur des analyses phosphoproteomics. Malgré la capacité de l’analyse LC-MS/MS à durée unique d’identifier 10 000 sites de phosphorylation21,22, la couverture de l’ensemble du phosphoprotéome végétal est encore limitée. Par conséquent, un flux de travail phosphoproteomic qui fournit une sensibilité élevée et une efficac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
