Fosfoproteomisk strategi for profilering av osmotisk stresssignalering i Arabidopsis
Summary
Presentert her er en fosfoproteomisk tilnærming, nemlig stoppe og gå ekstraksjon tips basert fosfoproteomisk, som gir høy gjennomstrømning og dyp dekning av Arabidopsis fosfoproteom. Denne tilnærmingen avgrenser oversikten over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Abstract
Proteinfosforylering er avgjørende for regulering av enzymaktivitet og genuttrykk under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserte fosfoproteomics har forvandlet måten å studere anlegget signal transduksjon. Imidlertid har kravet om mange startmaterialer og langvarig MS-måletid for å oppnå dybden av dekning vært den begrensende faktoren for den høye gjennomstrømningsstudien av globale fosfoproteomiske endringer i planter. For å forbedre følsomheten og gjennomstrømningen av plantefosfoproteomics, har vi utviklet en stopp og gå ekstraksjon (stadium) tipsbasert fosfoproteomics tilnærming kombinert med Tandem Mass Tag (TMT) merking for rask og omfattende analyse av plante fosforylering perturbasjon som svar på osmotisk stress. Ved hjelp av enkelheten og den høye gjennomstrømningen av trinnspissteknikk, tar hele prosedyren omtrent en time ved hjelp av to tips for å fullføre fosfoeptidberikelse, fraksjonering og prøverengjøringstrinn, noe som tyder på en brukervennlig og høy effektivitet av tilnærmingen. Denne tilnærmingen gir ikke bare en grundig plantefosfoproteomics analyse (> 11,000 fosfoeptid identifikasjon), men viser også overlegen separasjon effektivitet (< 5% overlapping) mellom tilstøtende fraksjoner. Videre er multipleksing oppnådd ved hjelp av TMT-merking for å kvantifisere fosfoproteomiske endringer av villtype og snrk2 decuple muterte planter. Denne tilnærmingen har med hell blitt brukt til å avsløre fosforyleringshendelsene til Raf-lignende kinaser som svar på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen av tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Introduction
Høy saltholdighet, lav temperatur og tørke forårsake osmotiske påkjenninger, noe som er en viktig miljøfaktor som påvirker planteproduktiviteten1,2. Proteinfosforylering er en av de viktigste post-translasjonelle modifikasjoner mediere signaloppfatning og transduksjon i planterespons på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relatert protein kinase 2s (SnRK2s) er involvert i osmotisk stress signalering6. Ni av ti medlemmer av SnRK2-familien viser betydelig aktivering som svar på osmotisk stress7,8. Snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutert med mutasjoner i alle ti SnRK2 viste overfølsomhet overfor osmotisk stress. I snrk2-dec mutant er den osmotiske stressinduserte akkumuleringen av inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic acid (ABA) biosyntese og genuttrykk sterkt redusert, og fremhever den vitale rollen til SnRK2s i osmotiske stressresponser6. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan SnRK2s kinaser regulerer disse biologiske prosessene. Profilering av fosfoproteomiske endringer som svar på osmotisk stress er en effektiv måte å bygge bro over dette gapet og å avgrense de osmotiske stressutløste forsvarsmekanismene i planter.
Massespektrometri (MS) er en kraftig teknikk for kartlegging av plantefosfoproteom9. Karakterisering av plantefosfoproteomics er imidlertid fortsatt en utfordring på grunn av det dynamiske spekteret av planteproom og kompleksiteten av plantelysat4. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi en universell plantefosfoproteomisk arbeidsflyt, som eliminerer uønskede forstyrrelser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter, og muliggjør dyp dekning av plantefosfoproteom10. Flere fosfoeptidberikelsesmetoder som immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC) og metalloksidkromatografi (MOC) er utviklet for berikende fosfoopeptider før MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-fosfoproeptider samtidig rensing med fosfokleptider er de viktigste forstyrrelsene for fosfoeptiddeteksjon. Tidligere standardiserte vi pH-verdien og organisk syrekonsentrasjon av IMAC-lastbuffer for å eliminere bindingen av ikke-fosfoopeptider, for å oppnå mer enn 90% berikelsespesifisitet som omgår pre-fraksjoneringstrinn11.
Prøvetap i flertrinnsprosessen av fosfoprotidberikelse og fraksjonering hindrer følsomheten til fosfoproeptididentifikasjon og dybden av fosfoproteomisk dekning. Stop-and-go-ekstraksjonsspisser (scenespisser) er pipettespisser som inneholder små disker for å dekke enden av spissen, som kan innlemmes med kromatografi for peptidfraksjon ogrengjøring 17. Prøvetap under trinnspissen kan minimeres ved å unngå prøveoverføring mellom rørene. Vi har implementert scenetips i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC for å skille lav rikelig flere fosforylerte peptider fra enkeltfosforylerte peptider, noe som forbedret dybden av menneskelig fosfoproteom15. I tillegg har bruken av høy pH reversert fase (Hp-RP) stadium tips vist bredere dekning av menneskelig membran proteom sammenlignet med sterk kation utveksling (SCX) og sterk anion utveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integrering av IMAC- og Hp-RP-trinns spissteknikker øke plantefosfoproteomdekningen med enkelhet, høy spesifisitet og høy gjennomstrømning. Vi har vist at denne strategien identifiserte mer enn 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis frøplanter, som representerer en forbedret dybde av plantefosfoproteom19.
Her rapporterer vi en stadium tipsbasert fosfoproteomisk protokoll for fosfoproteomisk profilering i Arabidopsis. Denne arbeidsflyten ble brukt til å studere fosfoproteomisk perturbasjon av villtype og snrk2-des muterte frøplanter som svar på osmotisk stress. Fosfoproteomisk analyse avslørte fosforyleringsstedene som er involvert i kinaseaktivering og tidlig osmotisk stresssignalering. Komparativ analyse av villtype og snrk2-des muterte fosfoproteomdata førte til oppdagelsen av en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade som spiller en nøkkelrolle i osmore stress signalering i høye planter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det dynamiske området og kompleksiteten til planteproom og fosfoproteom er fortsatt en begrensende faktor for dybden av fosfoproteomics analyser. Til tross for muligheten for enkeltkjøring LC-MS / MS analyse for å identifisere 10.000 fosforyleringnettsteder 21,22,dekningen av hele anlegget fosfoproteom er fortsatt begrenset. Derfor er det nødvendig med en fosfoproteomisk arbeidsflyt som gir høy følsomhet og overlegen separasjonseffektivitet for å profilere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Strategic Priority Research Program fra Det kinesiske vitenskapsakademiet, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
