마우스 망막 안료 상피의 빛 방출 전기 응답 기록을 위한 직접 결합 된 전기 전체노그램 (DC-ERG)
Summary
여기서, 우리는 2000년대 초에 Marmorstein, 복숭아 및 동료에 의해 처음 기술된 DC-ERGs로 알려져 있는 기술을 사용하여 마우스에서 망막 안료 상피(RPE)의 광유발 전기 반응을 기록하는 방법을 제시한다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE)는 광수용체의 전반적인 건강 및 구조적 무결성을 유지하는 망막과 초리오카세랄라증 사이에 전략적으로 위치한 세포의 특수 단층입니다. RPE는 편광되고, 정량적으로 그리고 기저적으로 위치한 수용체 또는 채널을 전시하고, 물, 이온, 대사 산물의 벡터 수송을 수행하고, 몇몇 사이토카인을 분비합니다.
RPGE 기능의 생체 내 비침습적 측정은 직접 결합된 ERGs(DC-ERGs)를 사용하여 이루어질 수 있다. DC-ERG의 방법론은 Marmorstein, 복숭아 및 동료가 맞춤형 자극 녹음 시스템을 사용하여 개척했으며 나중에 는 시판 가능한 시스템을 사용하여 시연되었습니다. DC-ERG 기술은 행크의 완충염 용액(HBSS)으로 채워진 유리 모세혈관을 사용하여 광수용체 활성으로 인한 감하 공간의 빛 유발 농도 변화로부터 유도된 RPE의 느린 전기 반응을 측정합니다. DC-ERG 레코딩의 장시간 광 자극과 길이는 드리프트및 노이즈에 취약하여 사용 가능한 레코딩의 수율이 낮습니다. 여기서는 진공 압력을 사용하여 HBSS 및 전극 홀더의 가스로 인한 기포를 줄이거나 제거하여 소음을 줄이면서 녹음의 안정성을 향상시키는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 또한 전압 레귤레이터/전원 컨디셔너를 사용하여 전력선 아티팩트가 감쇠됩니다. 우리는 시판되는 ERG 시스템에 필요한 빛 자극 프로토콜뿐만 아니라 DC-ERG 구성 요소의 분석을위한 스크립트를 포함 : c-웨이브, 빠른 진동, 빛 피크, 및 오프 응답. 기록의 용이성과 신속한 분석 워크플로우의 향상된 용이성으로 인해, 이 단순화된 프로토콜은 RPE 기능, 질병 진행 및 약리학적 개입 평가의 연령 관련 변화를 측정하는 데 특히 유용합니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 눈의 후방 세그먼트를 일렬로 세워 망막 항상성을 유지하기 위해 중요한 기능을 발휘하는특수 세포의 단층이다. RPE는 광수용체와 초리오카필로혈관4,5사이의 영양분 및 대사 산물의 수송에 참여하여 시각 주기2라는공정에서 광자 포획 시각적 안료를 재생하여 광수용체를 지원합니다. RPE 기능의 이상은 노화와 관련된 황반 변성6,Leber의 선천성 수마우로시스7,8 및 최고의 비텔리폼 황반 이영양증9와같은 수많은 인간 망막 질환을 뒷받침합니다. 기증자 눈 조직은 종종 연구 목적으로만 얻기 어렵기 때문에 유전자 변형을 가진 동물 모델은 망막 질환의 발달을 연구하는 대체 방법을 제공 할 수있습니다(10,11). 또한, CRISPR cas9 기술의 출현 및 적용은 이제 이전 유전자 표적화기술의한계를 능가하는 간단한 1단계 공정에서 게놈 소개(knock-in) 또는 삭제(knock-out)를 허용한다. 새로운 마우스모델(13)의 가용성 붐은 비침습적으로 RPE 기능을 평가하기 위해 보다 효율적인 기록 프로토콜을 필요로 합니다.
RPE의 광 유조 전기 반응의 측정은 직접 결합된 전기 전전도(DC-ERG) 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 광수용체(a-wave) 및 양극성(b-wave) 세포반응(14)을측정하는 기존의 ERG 레코딩과 함께 사용되는 경우, DC-ERG는 망막 변성과 RPE의 반응 특성이 어떻게 변하는지 를 정의할 수있다(15,16,17) 또는 RPE 기능 장애가 광수용체 손실보다 선행되는지 여부를 정의할 수 있다. 이 프로토콜은 DC-ERG기법16,18,19,20을 처음 개발한 Marmorstein, Peachey 및 동료의 작업에서 적응된 방법을 설명하고 재현성과 사용 편의성을 향상시킵니다.
DC-ERG 레코딩은 노이즈의 중단 이나 도입이 데이터의 해석을 복잡하게 할 수있는 동안 긴 수집 시간 (9 분)으로 인해 수행하기 가 어렵습니다. 이 새로운 방법의 장점은 기준선이 짧은 시간 내에 정상 상태에 도달하여 동물이 마취에서 조기에 깨어날 가능성을 줄이고 모세관 전극에서 거품 형성되기 쉽다는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요한 단계
좋은 DC-ERG 레코딩에는 마법물체와 원치 않는 드리프트를 만드는 거품이 없는 안정적인 전극이 필요합니다. 마우스 레코딩을 진행하기 전에 전극을 HBSS 목욕 용액에 배치할 때 안정적인 기준선이 달성되는 것이 필수적입니다. 작은 기포는 모세관 전극의 기저또는 실리콘 개스킷 주위에서 수집되는 경향이 있으며 전극 홀더가 완전히 조립되면 보기가 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NEI 교내 기금에 의해 지원되었다. 저자는 진심으로 RPE 생리학 및 질병에 대한 그의 과학적 지도, 기술 조언 및 전문 지식에 대한 박사 셸던 밀러를 인정합니다. 저자들은 메건 코페라와 마우스 식민지 관리를 위한 동물 관리 직원에게 감사를 표하고, 타룬 반살 박사, 레이몬드 저우, 위안 왕박사에게 기술 지원을 해주었습니다.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
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