Deze methodologie is gericht op het evalueren van biomateriaal cytotoxiciteit door de bereiding van oplosbare extracten, met behulp van levensvatbaarheidstests en fenotypische analyse, waaronder flowcytometrie, RT-PCR, immunocytochemie en andere cellulaire en moleculaire biologietechnieken.
Biomaterialen komen direct of indirect in contact met de menselijke weefsels, waardoor het belangrijk is om de cytotoxiciteit ervan te evalueren. Deze evaluatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar er bestaat een grote discrepantie tussen de gebruikte benaderingen, waardoor de reproduceerbaarheid en de vergelijking tussen de verkregen resultaten in het gedrang komen. In dit artikel stellen we een protocol voor om de cytotoxiciteit van biomaterialen te evalueren met behulp van oplosbare extracten, die we gebruiken voor tandheelkundige biomaterialen. De extractenbereiding is gedetailleerd, van de productie van pellets tot de extractie ervan in een kweekmedium. De cytotoxiciteitsevaluatie van biomaterialen is gebaseerd op metabole activiteit met behulp van de MTT-test, levensvatbaarheid van cellen met behulp van de Sulphorhodamine B (SBR) -test, celdoodprofiel door flowcytometrie en celmorfologie met behulp van May-Grünwald Giemsa. Naast cytotoxiciteitsevaluatie wordt een protocol beschreven om de celfunctie te evalueren op basis van de expressie van specifieke markers die zijn beoordeeld door immunocytochemie en PCR. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor de cytotoxiciteit van biomaterialen en de evaluatie van cellulaire effecten, met behulp van de extractenmethodologie, op een reproduceerbare en robuuste manier.
Biocompatibiliteit kan worden gedefinieerd als het vermogen van een materiaal om weefsel te integreren en een gunstige therapeutische respons te induceren, vrij van lokale en systemische schade 1,2,3. Biocompatibiliteitsevaluatie is cruciaal voor de ontwikkeling van elk materiaal dat bedoeld is voor medisch gebruik. Daarom biedt dit protocol een systematische en alomvattende aanpak voor elke onderzoeker die nieuwe biomaterialen wil ontwikkelen of nieuwe toepassingen voor bestaande biomaterialen wil bestuderen.
In vitro cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt als de eerste fase voor biocompatibiliteitsevaluatie, met behulp van primaire celculturen of cellijnen. De resultaten vormen een eerste indicator van mogelijke klinische toepassing. Naast het feit dat het van vitaal belang is voor de ontwikkeling van biomaterialen, is deze test verplicht om te voldoen aan de huidige regelgeving voor marktintroductie, van EUA- en EU-regelgevers (FDA- en CE-certificering)4,5,6,7,8. Bovendien bieden gestandaardiseerde tests in biomedisch onderzoek een aanzienlijk voordeel in termen van reproduceerbaarheid en vergelijking van resultaten van verschillende studies op vergelijkbare biomaterialen of apparaten9.
De richtlijnen van de International Organization for Standardization (ISO) worden veel gebruikt door meerdere onafhankelijke commerciële, regelgevende en academische laboratoria voor het testen van materialen op een nauwkeurige en reproduceerbare manier. De ISO 10993-5 verwijst naar de in vitro cytotoxiciteitsbeoordeling en de ISO 10993-12-rapporten naar bemonsteringsvoorbereiding10,11. Voor het testen van biomaterialen worden drie categorieën verstrekt, te selecteren op basis van het materiaaltype, contactweefsels en het behandelingsdoel: extracten, direct contact en indirect contact 8,11,12,13. Extracten worden verkregen door een celkweekmedium te verrijken met het biomateriaal. Voor de directe contacttests wordt het biomateriaal direct op de celculturen geplaatst en bij indirect contact wordt incubatie met de cellen uitgevoerd, gescheiden door een barrière, zoals een agarosegel11. Passende controles zijn verplicht en er moeten minimaal drie onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd 5,8,10,11,14.
Het is van cruciaal belang om klinische omstandigheden te simuleren of te overdrijven om het cytotoxische potentieel te bepalen. In het geval van extractentests, het oppervlak van het materiaal; het gemiddelde volume; het medium en de pH van het materiaal; de oplosbaarheid, osmolariteit en diffusieverhouding van het materiaal; en de extractieomstandigheden zoals agitatie, temperatuur en tijd beïnvloeden mediaverrijking5.
De methodologie maakt de kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van cytotoxiciteit van verschillende farmaceutische formuleringen, zowel vast als vloeibaar, mogelijk. Er kunnen verschillende testen worden uitgevoerd, zoals een neutrale rode opnametest, kolonievormingstest, MTT-test en XTT-test 5,10,14.
De meeste gepubliceerde cytotoxiciteitsbeoordelingsstudies gebruiken eenvoudigere testen, namelijk MTT en XTT, die beperkte informatie opleveren. De beoordeling van de biocompatibiliteit moet niet alleen de beoordeling van de cytotoxiciteit omvatten, maar ook de bioactiviteit van een bepaald testmateriaal2, zoals dit protocol onderschrijft. Aanvullende evaluatiecriteria moeten worden gebruikt wanneer dit gerechtvaardigd en gedocumenteerd is. Dit protocol is dus bedoeld om een uitgebreide gids te bieden, met een reeks methoden voor de evaluatie van de cytotoxiciteit van biomaterialen. Daarnaast wordt de evaluatie van verschillende cellulaire processen, namelijk het type celdood, celmorfologie, celfunctie bij de synthese van specifieke eiwitten en specifieke weefselproductie, beschreven.
Dit protocol is ontworpen rekening houdend met de ISO 10993-5, die verwijst naar de evaluatie van in vitro cytotoxiciteit van biomaterialen die in contact komen met de weefsels, om de biocompatibiliteit te evalueren en om bij te dragen aan de reproduceerbaarheid van studies21. Dit is een groeiende zorg in de wetenschap, en veel auteurs volgen deze aanbevelingen al in het experimentele ontwerp van hun in vitro studies 15,22,23,24,25,26,27,28.<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de volgende voor hun steun: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB wordt gefinancierd door nationale fondsen via FCT (Foundation for Science and Technology) via het strategische project UIDB / 04539 / 2020 en UIDP / 04539 / 2020 (CIBB). We danken Jacques Nör, University of Michigan Dental School, voor het leveren van de cellijn MDPC-23.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |