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Medicine

Accesso alla citotossicità e alla risposta cellulare ai biomateriali

Published: July 08, 2021
doi:
10.3791/61512
, , , , , , , , ,
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO),University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB),University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal

Summary

Questa metodologia mira a valutare la citotossicità dei biomateriali attraverso la preparazione di estratti solubili, utilizzando saggi di vitalità e analisi fenotipiche, tra cui citometria a flusso, RT-PCR, immunocitochimica e altre tecniche di biologia cellulare e molecolare.

Abstract

I biomateriali entrano in contatto diretto o indiretto con i tessuti umani, rendendo importante valutarne la citotossicità. Questa valutazione può essere eseguita con diversi metodi, ma esiste un’elevata discrepanza tra gli approcci utilizzati, compromettendo la riproducibilità e il confronto tra i risultati ottenuti. In questo articolo, proponiamo un protocollo per valutare la citotossicità dei biomateriali utilizzando estratti solubili, che utilizziamo per i biomateriali dentali. La preparazione degli estratti è dettagliata, dalla produzione di pellet alla sua estrazione in un terreno di coltura. La valutazione della citotossicità dei biomateriali si basa sull’attività metabolica utilizzando il saggio MTT, sulla vitalità cellulare utilizzando il saggio Sulphorhodamine B (SBR), sul profilo di morte cellulare mediante citometria a flusso e sulla morfologia cellulare utilizzando May-Grünwald Giemsa. Oltre alla valutazione della citotossicità, viene descritto un protocollo per valutare la funzione cellulare basato sull’espressione di marcatori specifici valutati mediante immunocitochimica e PCR. Questo protocollo fornisce una guida completa per la citotossicità dei biomateriali e la valutazione degli effetti cellulari, utilizzando la metodologia degli estratti, in modo riproducibile e robusto.

Introduction

La biocompatibilità può essere definita come la capacità di un materiale di integrare il tessuto e indurre una risposta terapeutica favorevole, priva di danni locali e sistemici 1,2,3. La valutazione della biocompatibilità è fondamentale per lo sviluppo di qualsiasi materiale destinato all’uso medico. Pertanto, questo protocollo fornisce un approccio sistematico e completo per ogni ricercatore che mira a sviluppare nuovi biomateriali o a studiare nuove applicazioni per i biomateriali esistenti.

I test di citotossicità in vitro sono ampiamente utilizzati come prima fase per la valutazione della biocompatibilità, utilizzando colture cellulari primarie o linee cellulari. I risultati costituiscono un primo indicatore di potenziale applicazione clinica. Oltre ad essere vitale per lo sviluppo di biomateriali, questo test è obbligatorio per conformarsi alle normative vigenti per l’introduzione sul mercato, da parte dei regolatori EUA e UE (certificazione FDA e CE)4,5,6,7,8. Inoltre, la sperimentazione standardizzata nella ricerca biomedica offre un vantaggio significativo in termini di riproducibilità e confronto dei risultati di diversi studi su biomateriali o dispositivi simili9.

Le linee guida ISO (International Organization for Standardization) sono ampiamente utilizzate da più laboratori commerciali, normativi e accademici indipendenti per testare i materiali in modo accurato e riproducibile. La ISO 10993-5 si riferisce alla valutazione della citotossicità in vitro e la ISO 10993-12 riporta la preparazione del campionamento10,11. Per l’analisi dei biomateriali sono previste tre categorie, da selezionare in base al tipo di materiale, ai tessuti a contatto e all’obiettivo del trattamento: estratti, contatto diretto e contatto indiretto 8,11,12,13. Gli estratti sono ottenuti arricchendo un terreno di coltura cellulare con il biomateriale. Per i test di contatto diretto, il biomateriale viene posto direttamente sulle colture cellulari e, in contatto indiretto, l’incubazione con le cellule viene eseguita separata da una barriera, come un gel di agarosio11. I controlli appropriati sono obbligatori e devono essere eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti 5,8,10,11,14.

È fondamentale simulare o esagerare le condizioni cliniche per determinare il potenziale citotossico. Nel caso di prove sugli estratti, la superficie del materiale;  il volume medio; il pH del mezzo e del materiale; il rapporto di solubilità, osmolarità e diffusione del materiale; e le condizioni di estrazione come l’agitazione, la temperatura e il tempo influenzano gli arricchimenti dei mezzi5.

La metodologia consente la valutazione quantitativa e qualitativa della citotossicità di diverse formulazioni farmaceutiche, sia solide che liquide. È possibile eseguire diversi test, come il test di captazione del rosso neutro, il test di formazione delle colonie, il test MTT e il test XTT 5,10,14.

La maggior parte degli studi di valutazione della citotossicità pubblicati utilizzano saggi più semplici, vale a dire MTT e XTT, che forniscono informazioni limitate. La valutazione della biocompatibilità non dovrebbe comportare solo la valutazione della citotossicità, ma anche la bioattività di un determinato materiale di prova2, come approvato dal presente protocollo. Ulteriori criteri di valutazione dovrebbero essere utilizzati quando giustificati e documentati. Pertanto, questo protocollo mira a fornire una guida completa, dettagliando una serie di metodi per la valutazione della citotossicità dei biomateriali. Inoltre, viene descritta la valutazione di diversi processi cellulari, vale a dire il tipo di morte cellulare, la morfologia cellulare, la funzione cellulare nella sintesi di proteine specifiche e la produzione di tessuti specifici.

Protocol

1. Preparazione del pellet Preparare gli stampi in cloruro di polivinile (PVC) eseguendo fori di forma circolare di dimensioni note in lastre di PVC.NOTA: le modanature in PVC possono essere realizzate di diverse dimensioni. Calcolare la superficie di contatto degli stampi in PVC, utilizzando la formula A = h (2πr) + 2πr2 (r: raggio del cilindro; h: altezza del cilindro). Preparare il biomateriale da testare secondo le istruzioni del produttore e il più vicino possibile all’inizio de…

Representative Results

I risultati rappresentativi qui si riferiscono allo studio dei biomateriali dentali. La metodologia dell’estratto consente di ottenere un profilo di citotossicità e funzione cellulare dopo l’esposizione ai materiali dentali, per quanto riguarda gli effetti sull’attività metabolica (Figura 2), la vitalità cellulare, il profilo di morte cellulare e la morfologia cellulare (Figura 3) e l’espressione di proteine specifiche (Figura 4).</strong…

Discussion

Questo protocollo è stato progettato prendendo in considerazione la ISO 10993-5, che si riferisce alla valutazione della citotossicità in vitro dei biomateriali che entrano in contatto con i tessuti, per valutare la biocompatibilità e contribuire alla riproducibilità degli studi21. Questa è una preoccupazione crescente nella scienza, e molti autori stanno già seguendo queste raccomandazioni nella progettazione sperimentale dei loro studi in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28.<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Si ringraziano per il supporto: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB è finanziato da fondi nazionali tramite FCT (Foundation for Science and Technology) attraverso il progetto strategico UIDB/04539/2020 e UIDP/04539/2020 (CIBB). Ringraziamo Jacques Nör, University of Michigan Dental School, per aver fornito la linea cellulare MDPC-23.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316
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Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).
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