इस पद्धति का उद्देश्य फ्लो साइटोमेट्री, आरटी-पीसीआर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और अन्य सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान तकनीकों सहित व्यवहार्यता परख और फेनोटाइपिक विश्लेषण का उपयोग करके घुलनशील अर्क की तैयारी के माध्यम से बायोमटेरियल साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करना है।
बायोमैटेरियल्स मानव ऊतकों के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से संपर्क करते हैं, जिससे इसकी साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण हो जाता है। यह मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है, लेकिन उपयोग किए गए दृष्टिकोणों के बीच एक उच्च विसंगति मौजूद है, जो प्रजनन क्षमता और प्राप्त परिणामों के बीच तुलना से समझौता करती है। इस पेपर में, हम घुलनशील अर्क का उपयोग करके बायोमैटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जिसका उपयोग हम दंत बायोमटेरियल्स के लिए करते हैं। अर्क की तैयारी विस्तृत है, छर्रों के उत्पादन से लेकर संस्कृति माध्यम में इसके निष्कर्षण तक। बायोमैटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन एमटीटी परख का उपयोग करके चयापचय गतिविधि, सल्फोरोडामाइन बी (एसबीआर) परख का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल डेथ प्रोफाइल और मई-ग्रुनवाल्ड गिम्सा का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान पर आधारित है। साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के अतिरिक्त, सेल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किए गए विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर वर्णित है। यह प्रोटोकॉल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत तरीके से अर्क पद्धति का उपयोग करके बायोमटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी और सेलुलर प्रभाव मूल्यांकन के लिए एक व्यापक मार्गदर्शिका प्रदान करता है।
जैव-रासायनिकता को ऊतक को एकीकृत करने और स्थानीय और प्रणालीगत क्षति 1,2,3 से मुक्त एक अनुकूल चिकित्सीय प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए एक सामग्री की क्षमता के रूप में परिभाषित किया जासकता है। चिकित्सा उपयोग के लिए किसी भी सामग्री के विकास के लिए जैव-अनुकूलता मूल्यांकन महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल प्रत्येक शोधकर्ता के लिए एक व्यवस्थित और व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसका लक्ष्य नए बायोमैटेरियल्स विकसित करना या मौजूदा बायोमटेरियल्स के लिए नए अनुप्रयोगों का अध्ययन करना है।
इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षणों को व्यापक रूप से प्राथमिक सेल संस्कृतियों या सेल लाइनों का उपयोग करके जैव-अनुकूलता मूल्यांकन के लिए पहले चरण के रूप में उपयोग किया जाता है। परिणाम संभावित नैदानिक अनुप्रयोग का पहला संकेतक बनाते हैं। जैव सामग्री विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के अलावा, यह परीक्षण ईयूए और यूरोपीय संघ के नियामकों (एफडीए और सीई प्रमाणन) 4,5,6,7,8 से बाजार परिचय के लिए वर्तमान नियमों का पालन करना अनिवार्य है। इसके अलावा, बायोमेडिकल अनुसंधान में मानकीकृत परीक्षण प्रजनन क्षमता और समान बायोमैटेरियल्सया उपकरणों पर विभिन्न अध्ययनों के परिणामों की तुलना के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है।
अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) दिशानिर्देशों का व्यापक रूप से सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से परीक्षण सामग्री के लिए कई स्वतंत्र वाणिज्यिक, नियामक और शैक्षणिक प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता है। आईएसओ 10993-5 इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन और आईएसओ 10993-12 रिपोर्ट को नमूना तैयारी10,11 को संदर्भित करता है। बायोमटेरियल परीक्षण के लिए तीन श्रेणियां प्रदान की जाती हैं, जिन्हें सामग्री प्रकार, संपर्क ऊतकों और उपचार लक्ष्य के अनुसार चुना जाता है: अर्क, प्रत्यक्ष संपर्क, और अप्रत्यक्ष संपर्क 8,11,12,13। अर्क बायोमटेरियल के साथ एक सेल कल्चर माध्यम को समृद्ध करके प्राप्त किए जाते हैं। प्रत्यक्ष संपर्क परीक्षणों के लिए, बायोमटेरियल को सीधे सेल संस्कृतियों पर रखा जाता है, और, अप्रत्यक्ष संपर्क में, कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन एक बाधा द्वारा अलग किया जाता है, जैसे कि एक एगारोस जेल11। उचित नियंत्रण अनिवार्य हैं, और कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग 5,8,10,11,14 किए जाने चाहिए।
साइटोटोक्सिक क्षमता निर्धारित करने के लिए नैदानिक स्थितियों को अनुकरण या अतिरंजित करना महत्वपूर्ण है। अर्क परीक्षण के मामले में, सामग्री का सतह क्षेत्र; मध्यम मात्रा; माध्यम और सामग्री पीएच; सामग्री घुलनशीलता, परासरणता और प्रसार अनुपात; और आंदोलन, तापमान और समय जैसी निष्कर्षण स्थितियां मीडिया को प्रभावित करतीहैं।
कार्यप्रणाली ठोस और तरल दोनों तरह के कई दवा योगों के साइटोटॉक्सिसिटी के मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देती है। कई परीक्षण किए जा सकते हैं, जैसे कि तटस्थ लाल अपटेक परीक्षण, कॉलोनी गठन परीक्षण, एमटीटी परख और एक्सटीटी परख 5,10,14।
प्रकाशित अधिकांश साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन अध्ययन सरल परख का उपयोग करते हैं, अर्थात् एमटीटी और एक्सटीटी, जो सीमित जानकारी प्रदान करते हैं। बायोकम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने में न केवल साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन शामिल होना चाहिए, बल्कि किसी दिए गए परीक्षण सामग्री2 की बायोएक्टिविटी भी शामिल होनी चाहिए, जैसा कि यह प्रोटोकॉल समर्थन करता है। उचित और प्रलेखित होने पर अतिरिक्त मूल्यांकन मानदंड का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बायोमटेरियल साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए तरीकों के एक सेट का विवरण देते हुए एक व्यापक गाइड प्रदान करना है। इसके अलावा, विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का मूल्यांकन, अर्थात् कोशिका मृत्यु का प्रकार, कोशिका आकृति विज्ञान, विशिष्ट प्रोटीन के संश्लेषण में कोशिका समारोह, और विशिष्ट ऊतक उत्पादन, वर्णित हैं।
इस प्रोटोकॉल को आईएसओ 10993-5 को ध्यान में रखते हुए डिज़ाइन किया गया था, जो बायोमैटेरियल्स के इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी के मूल्यांकन को संदर्भित करता है जो ऊतकों के साथ संपर्क करते हैं, जैव-रासायनिकता का म?…
The authors have nothing to disclose.
हम समर्थन के लिए निम्नलिखित को धन्यवाद देते हैं: जीएआई 2013 (फैकुलाडे डी मेडिसिना दा यूनिवर्सिडेड डी कोइम्ब्रा); सीआईबीबी को रणनीतिक परियोजना यूआईडीबी/04539/2020 और यूआईडीपी/04539/2020 (सीआईबीबी) के माध्यम से एफसीटी (फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी) के माध्यम से राष्ट्रीय निधि द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। सेल लाइन एमडीपीसी -23 प्रदान करने के लिए हम जैक्स नोर, मिशिगन डेंटल स्कूल विश्वविद्यालय को धन्यवाद देते हैं।
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |