Denne metoden tar sikte på å evaluere biomateriell cytotoksisitet gjennom fremstilling av løselige ekstrakter, ved hjelp av levedyktighetsanalyser og fenotypisk analyse, inkludert flowcytometri, RT-PCR, immunocytokjemi og andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.
Biomaterialer kommer i direkte eller indirekte kontakt med humant vev, noe som gjør det viktig å evaluere cytotoksisiteten. Denne evalueringen kan utføres ved flere metoder, men det er stor uoverensstemmelse mellom tilnærmingene som brukes, noe som kompromitterer reproduserbarheten og sammenligningen mellom de oppnådde resultatene. I dette papiret foreslår vi en protokoll for å evaluere biomaterialer cytotoksisitet ved hjelp av løselige ekstrakter, som vi bruker til dentale biomaterialer. Ekstraktpreparatet er detaljert, fra pelletsproduksjon til ekstraksjon i et kulturmedium. Cytotoksisitetsevalueringen av biomaterialer er basert på metabolsk aktivitet ved bruk av MTT-analysen, cellelevedyktighet ved bruk av sulforhodamin B (SBR)-analysen, celledødsprofil ved flowcytometri og cellemorfologi ved bruk av May-Grünwald Giemsa. I tillegg til cytotoksisitetsevaluering beskrives en protokoll for å evaluere cellefunksjon basert på ekspresjon av spesifikke markører vurdert ved immuncytokjemi og PCR. Denne protokollen gir en omfattende veiledning for evaluering av biomaterialers cytotoksisitet og cellulære effekter, ved hjelp av ekstraktmetodikken, på en reproduserbar og robust måte.
Biokompatibilitet kan defineres som kapasiteten til et materiale til å integrere vev og indusere en gunstig terapeutisk respons, fri for lokale og systemiske skader 1,2,3. Biokompatibilitetsevaluering er avgjørende for utviklingen av ethvert materiale beregnet på medisinsk bruk. Derfor gir denne protokollen en systematisk og omfattende tilnærming for alle forskere som tar sikte på å utvikle nye biomaterialer eller studere nye applikasjoner for eksisterende biomaterialer.
In vitro cytotoksisitetstester er mye brukt som den første fasen for biokompatibilitetsevaluering, ved bruk av primære cellekulturer eller cellelinjer. Resultatene utgjør en første indikator på potensiell klinisk anvendelse. Foruten å være avgjørende for utviklingen av biomateriale, er denne testingen obligatorisk for å overholde gjeldende forskrifter for markedsintroduksjon, fra EUA- og EU-regulatorer (FDA og CE-sertifisering) 4,5,6,7,8. Videre gir standardisert testing i biomedisinsk forskning en betydelig fordel når det gjelder reproduserbarhet og sammenligning av resultater fra ulike studier på lignende biomaterialer eller enheter9.
International Organization for Standardization (ISO) retningslinjer er mye brukt av flere uavhengige kommersielle, regulatoriske og akademiske laboratorier for testing av materialer på en nøyaktig og reproduserbar måte. ISO 10993-5 refererer til in vitro cytotoksisitetsvurderingen og ISO 10993-12 rapporterer til prøvetakingspreparat10,11. For biomaterialtesting er tre kategorier gitt, som skal velges i henhold til materialtype, kontaktvev og behandlingsmål: ekstrakter, direkte kontakt og indirekte kontakt 8,11,12,13. Ekstrakter oppnås ved å berike et cellekulturmedium med biomaterialet. For direkte kontakttester plasseres biomaterialet direkte på cellekulturer, og i indirekte kontakt utføres inkubasjon med cellene separert av en barriere, slik som en agarosegel11. Passende kontroller er obligatoriske, og minst tre uavhengige eksperimenter bør utføres 5,8,10,11,14.
Det er kritisk å simulere eller overdrive kliniske tilstander for å bestemme det cytotoksiske potensialet. Ved testing av ekstrakter, materialets overflateareal; middels volum; mediet og materialet pH; materialløseligheten, osmolariteten og diffusjonsforholdet; og utvinningsforholdene som agitasjon, temperatur og tid påvirker medienes berikelse5.
Metoden tillater kvantitativ og kvalitativ evaluering av cytotoksisitet av flere farmasøytiske formuleringer, både faste og flytende. Flere analyser kan utføres, for eksempel nøytral rød opptakstest, kolonidannelsestest, MTT-analyse og XTT-analyse 5,10,14.
De fleste publiserte cytotoksisitetsstudier bruker enklere analyser, nemlig MTT og XTT, som gir begrenset informasjon. Evaluering av biokompatibilitet bør ikke bare innebære vurdering av cytotoksisitet, men også bioaktivitet av et gitt testmateriale2, som denne protokollen støtter. Ytterligere evalueringskriterier bør brukes når det er berettiget og dokumentert. Dermed tar denne protokollen sikte på å gi en omfattende veiledning som beskriver et sett med metoder for evaluering av biomaterialets cytotoksisitet. Dessuten beskrives evalueringen av forskjellige cellulære prosesser, nemlig typen celledød, cellemorfologi, cellefunksjon i syntesen av spesifikke proteiner og spesifikk vevsproduksjon.
Denne protokollen ble utformet under hensyntagen til ISO 10993-5, som refererer til evaluering av in vitro cytotoksisitet av biomaterialer som kommer i kontakt med vevet, for å evaluere biokompatibiliteten og for å bidra til studier reproduserbarhet21. Dette er en økende bekymring i vitenskapen, og mange forfattere følger allerede disse anbefalingene i den eksperimentelle utformingen av deres in vitro-studier 15,22,23,24,25,26,27,28.<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker følgende for støtte: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB er finansiert av National Funds via FCT (Foundation for Science and Technology) gjennom det strategiske prosjektet UIDB/04539/2020 og UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi takker Jacques Nör, University of Michigan Dental School, for å gi cellelinjen MDPC-23.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |