Denne metode sigter mod at evaluere biomateriale cytotoksicitet gennem fremstilling af opløselige ekstrakter ved anvendelse af levedygtighedsanalyser og fænotypisk analyse, herunder flowcytometri, RT-PCR, immunocytokemi og andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.
Biomaterialer kommer i direkte eller indirekte kontakt med det humane væv, hvilket gør det vigtigt at evaluere dets cytotoksicitet. Denne evaluering kan udføres ved flere metoder, men der er en stor uoverensstemmelse mellem de anvendte tilgange, hvilket kompromitterer reproducerbarheden og sammenligningen mellem de opnåede resultater. I dette papir foreslår vi en protokol til evaluering af biomaterialer cytotoksicitet ved hjælp af opløselige ekstrakter, som vi bruger til dental biomaterialer. Ekstraktpræparatet er detaljeret, fra pelletproduktion til dets ekstraktion i et dyrkningsmedium. Biomaterialernes cytotoksicitetsevaluering er baseret på metabolisk aktivitet ved anvendelse af MTT-assayet, cellelevedygtighed ved anvendelse af Sulphorhodamine B (SBR) assay, celledødsprofil ved flowcytometri og cellemorfologi ved anvendelse af May-Grünwald Giemsa. Ud over cytotoksicitetsevaluering beskrives en protokol til evaluering af cellefunktion baseret på ekspression af specifikke markører vurderet ved immunocytokemi og PCR. Denne protokol giver en omfattende vejledning til evaluering af cytotoksicitet og cellulære virkninger af biomaterialer ved hjælp af ekstraktmetoden på en reproducerbar og robust måde.
Biokompatibilitet kan defineres som et materiales evne til at integrere væv og fremkalde et gunstigt terapeutisk respons, fri for lokale og systemiske skader 1,2,3. Biokompatibilitetsevaluering er afgørende for udviklingen af ethvert materiale beregnet til medicinsk brug. Derfor giver denne protokol en systematisk og omfattende tilgang til enhver forsker, der sigter mod at udvikle nye biomaterialer eller studere nye anvendelser af eksisterende biomaterialer.
In vitro cytotoksicitetstest anvendes i vid udstrækning som den første fase til evaluering af biokompatibilitet ved anvendelse af primære cellekulturer eller cellelinjer. Resultaterne udgør en første indikator for potentiel klinisk anvendelse. Udover at være afgørende for udviklingen af biomateriale, er denne test obligatorisk for at overholde gældende regler for markedsintroduktion fra EUA og EU-regulatorer (FDA og CE-certificering)4,5,6,7,8. Desuden giver standardiseret test inden for biomedicinsk forskning en betydelig fordel med hensyn til reproducerbarhed og sammenligning af resultater fra forskellige undersøgelser af lignende biomaterialer eller udstyr9.
International Organization for Standardization (ISO) retningslinjer bruges i vid udstrækning af flere uafhængige kommercielle, lovgivningsmæssige og akademiske laboratorier til test af materialer på en nøjagtig og reproducerbar måde. ISO 10993-5 henviser til in vitro cytotoksicitetsvurderingen og ISO 10993-12 rapporterer til prøvetagningsforberedelse10,11. Til biomaterialetest leveres tre kategorier, der skal vælges i henhold til materialetype, kontaktvæv og behandlingsmålet: ekstrakter, direkte kontakt og indirekte kontakt 8,11,12,13. Ekstrakter opnås ved at berige et cellekulturmedium med biomaterialet. Til test af direkte kontakt placeres biomaterialet direkte på cellekulturerne, og ved indirekte kontakt udføres inkubation med cellerne adskilt af en barriere, såsom en agarosegel11. Passende kontrol er obligatorisk, og der skal udføres mindst tre uafhængige forsøg 5,8,10,11,14.
Det er afgørende at simulere eller overdrive kliniske tilstande for at bestemme det cytotoksiske potentiale. I tilfælde af ekstraktafprøvning, materialets overfladeareal; det mellemstore volumen; substratet og materialets pH-værdi forholdet mellem materialeopløselighed, osmolaritet og diffusion og ekstraktionsbetingelserne som omrøring, temperatur og tid påvirker medieberigere5.
Metoden tillader kvantitativ og kvalitativ evaluering af cytotoksicitet af flere farmaceutiske formuleringer, både faste og flydende. Flere assays kan udføres, såsom neutral rød optagelsestest, kolonidannelsestest, MTT-assay og XTT-assay 5,10,14.
De fleste offentliggjorte cytotoksicitetsvurderingsundersøgelser bruger enklere assays, nemlig MTT og XTT, som giver begrænset information. Evaluering af biokompatibilitet bør ikke kun omfatte vurdering af cytotoksicitet, men også bioaktivitet af et givet testmateriale2, som denne protokol godkender. Der bør anvendes yderligere evalueringskriterier, når det er begrundet og dokumenteret. Denne protokol har således til formål at give en omfattende vejledning, der beskriver et sæt metoder til evaluering af biomaterialets cytotoksicitet. Desuden beskrives evalueringen af forskellige cellulære processer, nemlig typen af celledød, cellemorfologi, cellefunktion i syntesen af specifikke proteiner og specifik vævsproduktion.
Denne protokol blev udformet under hensyntagen til ISO 10993-5, som henviser til evaluering af in vitro cytotoksicitet af biomaterialer, der kommer i kontakt med vævene, for at evaluere biokompatibiliteten og bidrage til undersøgelser af reproducerbarhed21. Dette er en voksende bekymring inden for videnskab, og mange forfattere følger allerede disse anbefalinger i det eksperimentelle design af deres in vitro-undersøgelser 15,22,23,24,25,26,27,28.<sup…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker følgende for støtte: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB finansieres af nationale midler via FCT (Foundation for Science and Technology) gennem det strategiske projekt UIDB/04539/2020 og UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi takker Jacques Nör, University of Michigan Dental School, for at levere cellelinjen MDPC-23.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
Glycerol | Dako | C0563 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
β-actin antibody | Sigma | A5316 |