الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً للحد الأدنى من الانبعاثات البويضية غير الناضجة من البويضات القطة مع وسائل الإعلام المختبرية الصنع على الدعامات التجارية. وهو يغطي كل خطوة من عزل البويضات من الزناد السابقين vivo إلى التزجيج والاحترار.
Abstract
وفي برامج حفظ الحيوانات البرية، تعتبر الخدمات المصرفية للـ “جاميت” ضرورية لحماية الموارد الوراثية للأفراد القيمين والأنواع النادرة ولتعزيز الحفاظ على التنوع البيولوجي. في felids ، ومعظم الأنواع مهددة بالانقراض ، وتستخدم السلالات المنزلية كنموذج لزيادة كفاءة بروتوكولات لsyseds. بين تقنيات الحفظ بالتبريد البويضات، التبخيل هو أكثر وأكثر شعبية في التكاثر بمساعدة الإنسان والطب البيطري. وقد ثبت أن التزجيج في محطة التبريد، الذي تم تطويره في البداية للبويضات والأجنة البشرية، مناسب تمامًا لبويضات القطط. تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا، مثل الجدوى في ظروف الحقل وسرعة الإجراء، والتي يمكن أن تكون مفيدة عندما تحتاج عدة عينات إلى المعالجة. ومع ذلك، تعتمد الكفاءة بشدة على مهارات المشغل، ويلزم توحيد المعايير داخل المختبرات وفيما بينها، فضلا عن تدريب الموظفين. يصف هذا البروتوكول الحد الأدنى من حجم البويضات البرازية غير ناضجة على دعم تجاري في خطوة بخطوة بروتوكول ودية المجال، من جمع البويضة إلى الاحترار. وبعد البروتوكول، الحفاظ على سلامة البويضات وقابليتها للبقاء عند الاحترار (يصل إلى 90 في المائة) يمكن توقع ذلك، على الرغم من أنه لا يزال هناك مجال للتحسين في مرحلة النضج بعد الاحترار ونتائج التنمية الجنينية.
Introduction
وقد أصبح الحفظ بالتبريد خطوة رئيسية في تقنيات المساعدة على الإنجاب .. في البشر ، فإنه يسمح للحفاظ على الخصوبة أو تأجيل الأبوة لأسباب طبية أو شخصية. في الحيوانات، من الضروري التغلب على المسافة والوقت في التزاوج المخطط له، وخاصة في المزرعة والحيوانات الأليفة، أو للحفاظ على المواد الوراثية للمواضيع القيمة في برامج الحفظ، وخاصة في الأنواع البرية المهددة بالانقراض. حفظ البردي جاميت هو الخيار الأفضل عندما لم يتم اختيار الأفراد الذين سيتم تربيتهم بعد أو من أجل تجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة بتجميد الجنين ، وخاصة في الطب البشري1. من السهل نسبيا الحفاظ على الحيوانات المنوية وإعطاء نتائج مرضية بعد ذوبان الجليد، ولكن البويضات، بسبب ميزاتها الهيكلية، قد تكون أكثر تعقيدا لتخزين. في الواقع، وانخفاض نسبة السطح/الحجم، فضلا عن وجود pellucida زونا المحيطة ooplasma، يحد من حركة المواد وايروبروت المياه عبر الخلية2. وعلاوة على ذلك، في الحيوانات الأليفة بما في ذلك felids، فهي تتميز السيتوبلازم الغنية بالدهون، والتي يعتقد لجعلها أكثر حساسية للتبريد3.
معظم felids مهددة، ويتم استخدام القط المحلي كنموذج لتطوير بروتوكولات للحفاظ على germplasm بفضل توافر السنادات من استئصال الأوفاريت الروتينية. في الحيوانات البرية، يمكن الحصول على السناد بعد العمليات الجراحية الاختيارية أو (أكثر تواترا) بعد الوفاة،ويمكن استرداد غير ناضجة (حاصلة الجرثومية) شعماش. التحفيز الهرموني تهدف إلى الحصول على ناضجة (metaphase II) البويضات ليست شائعة كما هو الحال في ARTs الإنسان بسبب القضايا الأخلاقية والأنواع الفردية استجابة محددة للعلاجات4.
ولذلك ، فإن تطوير استراتيجيات الحفظ بالتبريد قد ركز على الأمرات غير الناضجة ، والتي يمكن استردادها عادة بعد الوفاة غير المتوقعة أو المفاجئة للأفراد النادرين. من وجهة نظر بيولوجية، وهناك بعض الاختلافات في حفظ التبريد من الأمهان غير ناضجة أو ناضجة، كل له مزاياه. أولاً، الحمض النووي هو أكثر حماية في البويضات غير ناضجة، الذي الحويوش الجرثومية يحتوي على الكروموسومات محاطة غشاء نووي، في حين أن المغزل الميوتيك من البويضات الفوقية II يمكن أن تكون أكثر عرضة للتبريد5. ثانيا، قد تؤثر الأضرار الناجمة عن الهيكل الكيسي الناجم عن البرد على دوران المغزل، وبثق الجسم القطبي، والهجرة البرونوية والسيكينسيس، والتي يمكن أن يكون لها آثار مختلفة وفقا لمرحلة نمو البويض، مما يؤثر على تطور الداء الميموري أو أحداث ما بعد الإخصاب. وأخيرا، وربما الأهم من ذلك، في حين أن البويضات الناضجة هي على استعداد لتكون المخصبة، gametes غير ناضجة تعتمد على دعم الخلايا المكمّلة المحيطة بها للذهاب من خلال النووية ونضوج6السيتوبلازمية ، وهذا هو السبب في أن المجمعات كاملة cumulus-oocyte (COCs) هي cryopreserved. ومع ذلك ، فإن فقدان خلايا الركام و / أو فقدان الاتصال الوظيفي بين gamete والخلايا الجسدية المحيطة هي على الأرجح التأثير الأكثر ضررًا للالحفاظ على التبريد من COCs غير الناضجة.
من بين تقنيات الحفظ بالتبريد ، تزجيج هو واحد التي يمكن تطبيقها بسهولة أكبر في ظروف الميدان. مقارنة بالتجميد البطيء (أو المعدل الخاضع للرقابة)، فإن عملية التزجيج أسرع ولا تتطلب معدات محددة، مثل الفريزر القابل للبرمجة. من أجل تلبية المبادئ الأساسية الثلاثة للزهية (أي اللزوجة العالية ، متصلة بتركيز عالي من المواد المبردة ، وأحجام صغيرة وانخفاض درجة حرارة فائقة السرعة) ، تم تطوير العديد من الوسائط والدعم بشكل خاص واستخدامه في القطط لكل من البويضات غير الناضجة والناضجة. بدءا من القش البسيط7، ثم تم تطوير الأجهزة للوصول إلى “الحد الأدنى من حجم” الهدف. Cryoloop8، فتح سحب القش (OPS)9، المزاريب البلاستيكية (القش المعدل)10 و 11 وقد استخدمت11، حتى جهاز أكثر كفاءة (أي، Cryotop) تم توظيف11، وتحسين البقاء على قيد الحياة واستئناف meiosis. Cryotop(الشكل التكميلي 1)هو دعم متاح تجاريًا والذي أصبح نظامًا مفتوحًا اختياريًا للاختراق. وضعت ل vitrification من البويضات البشرية والأجنة ، ويتكون من شريط فيلم صغير تعلق على حامل من البلاستيك الصلب ، محمية من قبل غطاء أنبوب من البلاستيك أثناء التخزين12. بفضل سهولة الاستخدام والتخفيض الشديد في حجم التكطيب (أقل من 0.1 ميكرولتر) ، مما يؤدي أيضًا إلى معدلات تبريد والاحترار السريعة للغاية ، تم تطبيق دعم التهتر هذا بشكل متزايد في العديد من الأنواع ، بما في ذلك القط المنزلي ، والذي تم استخدامه مع مجموعة متنوعة من الوسائط13و14و,15و16و17.
الغرض من هذه المخطوطة هو وصف بروتوكول الدفء الجمعي، مع تعديلات طفيفة من واحد وضعت أصلا لبويضات الإنسان، والذي يستخدم وسائل الإعلام المختبرية الصنع والدعم التجاري للحد الأدنى من حجم التبخيل ويمكن تطبيقها بسهولة في ظروف الحقل للرفرف في التبريد من COCs القطط غير ناضجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحفظ بالتبريد البويضات هو تقنية حفظ الجراثيم الحاسمة، وخاصة في التاشيا حيث العديد من الأنواع المهددة بالانقراض، مثل عائلة فيليداي. في هذه المخطوطة، تم تقديم بروتوكول بسيط وصديق للحقل لتكطيب البويضات غير الناضجة من القطط. وسائل الإعلام المختبرية الصنع، والحد الأدنى من دعم الtrification حجم و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل EVSSAR (الجمعية البيطرية الأوروبية لتكاثر الحيوانات الصغيرة) منحة 2016 ومن جامعة degli Studi di Milano، Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). ونود أيضا أن نشكر الدكتورة ماريا جيوجيرجيا مورسيلي على مساهمتها في التجارب التي تم تصويرها في هذا واقتناء الصور.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
