Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu
Summary
Bu el yazması, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının ticari destekler de laboratuvar yapımı ortamla minimum hacimli vitrifikasyonuna ilişkin bir protokolü açıklamaktadır. Oosit izolasyonundan ex vivo gonadlardan vitrifikasyon ve ısınmaya kadar her adımı kapsar.
Abstract
Vahşi hayvanların koruma programlarında, gamet bankacılığı değerli bireylerin ve nadir türlerin genetik kaynaklarını korumak ve biyolojik çeşitliliğin korunmasını teşvik etmek için çok önemlidir. Felids, çoğu tür yok olma tehlikesiyle karşı karşıya, ve yerli ırklar germplasm bankacılık için protokollerin verimliliğini artırmak için bir model olarak kullanılır. Oosit kriyoprezervasyon teknikleri arasında, vitrifikasyon insan ve veteriner destekli üreme daha popüler. İlk olarak insan yumurtaları ve embriyolar için geliştirilen cryotop vitrifikasyon, kedi yumurtaları için çok uygun olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, alan koşullarındafizibilite ve yordamın hızı gibi çeşitli avantajlar sunar ve bu da birkaç numunenin işlenmesi gerektiğinde yararlı olabilir. Ancak, verimlilik güçlü operatörün becerilerine bağlıdır ve intra-ve laboratuvarlar arası standardizasyon yanı sıra personel eğitimi gereklidir. Bu protokol, yumurta koleksiyonundan ısınmaya kadar, adım adım alan dostu protokolile ticari destek te olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimli vitrifikasyonu dur. Protokolün ardından, yumurta bütünlüğünün ve ısınmada canlılığın korunması (%90’a kadar) ısınma sonrası olgunlaşma ve embriyonik gelişim sonuçlarında iyileşme için hala yer olmasına rağmen, beklenebilir.
Introduction
Kriyopreservation destekli üreme teknikleri (ARTs) önemli bir adım haline gelmiştir. İnsanlarda, bu tıbbi veya kişisel nedenlerle doğurganlık korunması veya ebeveynlik ertelenmesi sağlar. Hayvanlarda, özellikle çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlarda, planlanan çiftliklerde mesafe ve zamanın üstesinden gelmek ya da özellikle nesli tükenmekte olan vahşi türler olmak üzere koruma programlarındaki değerli deneklerin genetik materyallerini korumak gereklidir. Gamet kriyoppreservation bireylerin henüz seçilmiş değil ya da amacıyla embriyo dondurma ile ilgili etik sorunları önlemek için, özellikle insan tıbbı1en iyi seçimdir. Spermatozoakorumak ve erime sonra tatmin edici sonuçlar vermek nispeten kolaydır, ancak yumurta, yapısal özellikleri nedeniyle, saklamak için daha karmaşık olabilir. Nitekim, düşük yüzey / hacim oranı, hem de ooplazma çevreleyen zona pellucida varlığı,hücre2 boyunca kriyoprotektif ve su hareketini sınırlar . Ayrıca, felidler de dahil olmak üzere evcil hayvanlarda, onlar kriyopreservation3onları daha duyarlı hale getirmek için düşünülen bir lipid açısından zengin sitoplazma ile karakterizedir.
En felids tehdit altındadır, ve evcil kedi rutin ovariektomi gelen gonadların durumu sayesinde germplasm korunması için protokoller geliştirmek için bir model olarak kullanılır. Vahşi hayvanlarda, gonadlar elektif ameliyatlardan sonra veya (daha sık) post-mortemsonra elde edilebilir, ve olgunlaşmamış (germinal vezikül) gametler alınabilir. Hormonal stimülasyon olgun elde etmek için amaçlayan (metafaz II) oositler etik sorunlar ve tür nedeniyle insan ARTs olarak yaygındeğildir-ve tedavilere bireysel-özel yanıt 4 .
Bu nedenle, kriyoprezervasyon stratejilerinin geliştirilmesi genellikle nadir bireylerin beklenmedik veya ani ölümünden sonra alınabilir olgunlaşmamış gametler, odaklanmıştır. Biyolojik bir bakış açısıyla, her birinin avantajları olan olgunlaşmamış veya olgun gametlerin kriyopreservation bazı farklılıklar vardır. İlk olarak, DNA daha olgunlaşmamış oositler korunur, olan germinal vezikül bir nükleer membran ile çevrili kromozomlar içerir, metafaz II oositlerin meiotik mil kriyoyaralanmalara karşı daha savunmasız olabilirise 5. İkinci olarak, soğuk kaynaklı sitoiskelet hasarları iğ rotasyonunu, kutup cisim ekstrüzyonu, pronükleer göç ve sitokinezi etkileyebilir, bu da oosit gelişim evresine göre farklı etkilere yol açabilir, mayoz progresyonu veya döllenme sonrası olayları etkileyebilir. Son olarak, ve belki de en önemlisi, olgun yumurtadöllenmeye hazır iken, olgunlaşmamış gametler nükleer ve sitoplazmikolgunlaşma6 geçmesi için çevreleyen kümülüs hücrelerinin desteğine güveniyor , ve bu nedenle tüm kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) cryopreserved vardır. Ancak, kümülüs hücrelerinin kaybı ve/veya gamet ve çevresindeki somatik hücreler arasındaki fonksiyonel bağlantının kaybı muhtemelen olgunlaşmamış COC’lerin kriyopreservation en zararlı etkisidir.
Kriyopreservation teknikleri arasında vitrifikasyon alan koşullarında daha kolay uygulanabilen bir tekniktir. Yavaş (veya kontrollü hız) dondurma ile karşılaştırıldığında, vitrifikasyon daha hızlıdır ve programlanabilir bir dondurucu gibi belirli ekipmanlar gerektirmez. Vitrifikasyonun üç temel prensibini (yani yüksek viskozite, yüksek kriyoprotektif konsantrasyon, küçük hacimler ve ultra hızlı sıcaklık düşüşüne bağlı) karşılamak için, özellikle olgunlaşmamış ve olgun yumurtalar için kedilerde çeşitli ortam ve destekler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Basit pipetler7ile başlayarak, cihazlar daha sonra “Minimum hacim” hedefine ulaşmak için geliştirilmiştir. Cryoloop8, açık çekti pipetler (OPS)9, plastik oluklar (modifiye saman)10 ve kriyotüpler11 kullanılmıştır, kadar daha verimli bir cihaz (yani, Cryotop) istihdam edildi11, hayatta kalma ve kızamık devamı iyileştirilmesi. Cryotop (Ek Şekil 1) vitrifikasyon için seçmeli açık sistem haline gelmiştir ticari olarak kullanılabilir bir destektir. İnsan yumurtaları ve embriyoların vitrifikasyon için geliştirilen, bu depolama sırasında plastik bir tüp kapağı ile korunan sert bir plastik tutucu bağlı küçük bir film şerit oluşur12. Kullanılabilirliği ve vitrifikasyon hacmindeki aşırı azalma (0,1 μL gibi az), aynı zamanda son derece hızlı soğutma ve ısınma oranlarıyol açar, bu vitrifikasyon desteği giderek çeşitli medya13,,14,15,16,17ile kullanılmıştır yerli kedi de dahil olmak üzere çeşitli türler, uygulanmıştır .
Bu makalenin amacı, insan yumurtaları için başlangıçta geliştirilen, minimum hacimli vitrifikasyon için laboratuvar yapımı medya ve ticari destekler kullanan ve olgunlaşmamış kedi COC’larının kriyopreservation için saha koşullarında kolayca uygulanabilen küçük değişikliklerle bir koleksiyon-vitrifikasyon-ısınma protokolünü tanımlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oosit kriyoprezervasyon felidae ailesi gibi birçok türün nesli tükenmekte olan taksonlarda özellikle önemli bir germplazm koruma tekniğidir. Bu yazıda, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının vitrifikasyonu için basit ve alan dostu bir protokol sunulmuştur. Laboratuvar yapımı ortam, minimum hacim vitrifikasyon destekleri ve eğitimli personel, bu yöntemin başarısı için önemli faktörlerdir, bu da temsili sonuçlarda gösterildiği gibi sürekli ve sürekli olarak canlı yumurtaların elde edilmesine olan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen EVSSAR (Avrupa Küçük Hayvan Üreme Derneği) Grant 2016 ve Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. MariaGiorgia Morselli’ye burada betimlenen deneylere ve görüntü edinimine olan katkıları için teşekkür ederiz.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
