未熟ネコの最小体積ガラス化
Summary
本稿は、商業的支援上の実験室製のメディアを用いた未熟な猫卵母細胞の最小体積ガラス化のためのプロトコルを記述する。それは、エキビボ生殖腺からガラス化および温暖化に至る卵母細胞の分離からあらゆるステップをカバーする。
Abstract
野生動物の保護プログラムでは、有価者や希少種の遺伝資源を保護し、生物多様性保全を促進するために、テガレバンキングが重要です。フェリドでは、ほとんどの種が絶滅の危機に瀕しており、国内の品種は、ゲルプラズムバンキングのためのプロトコルの効率を高めるためのモデルとして使用されています。卵母細胞凍結保存技術の中で、ガラス化はヒトおよび獣医支援生殖においてますます普及している。ヒト卵母細胞および胚のために最初に開発されたクライオトップガラス化は、猫の卵母細胞に適することが実証された。この方法には、フィールド条件の実現可能性や手順の速度など、いくつかの利点があり、いくつかのサンプルを処理する必要がある場合に役立ちます。しかし、効率はオペレータのスキルに大きく依存し、ラボ内およびラボ間の標準化、および人員訓練が必要です。このプロトコルは、卵母細胞の収集から温暖化まで、ステップバイステップのフィールドフレンドリーなプロトコルで商業的サポート上の未熟なネコ卵母細胞の最小体積ガラス化を記述する。プロトコルに従って、温暖化時の卵母細胞の完全性と生存率の維持(90%まで高い)温暖化後の成熟と胚発生の結果にはまだ改善の余地があるが、期待できる。
Introduction
凍結保存は、再生支援技術(ART)の重要なステップとなっています。人間では、医療や個人的な理由で生殖能力の保持や親の延期を可能にします。動物では、特に家畜やペットの計画交配の距離と時間を克服したり、特に野生の絶滅危惧種の保全プログラムで貴重な被験者の遺伝物質を保存する必要があります。配育する個体がまだ選ばれていない場合、または特にヒト医学における胚凍結に関連する倫理的問題を回避するために、配られる人が選ばれなかった場合の最良の選択である。精子は比較的簡単に保存し、解凍後に満足のいく結果を与えるが、卵母細胞は、その構造的特徴のために、保存するのがより複雑である可能性がある。実際、低い表面/体積比は、卵形プラズマを囲む透明帯の存在と同様に、細胞2を横切る凍結保護剤および水の移動を制限する。さらに、フェリドを含む家畜では、脂質が豊富な細胞質が特徴であり、凍結保存に対してより敏感であると考えられている。
ほとんどのフェリドは脅かされ、家畜猫は定期的な卵巣切除術から生殖腺が利用可能なおかげで生殖器保存のためのプロトコルを開発するためのモデルとして使用されます。野生動物では、生殖腺は、選択的手術後、または(より頻繁に) 死後に得ることができ、未熟な(胚芽小胞)配偶を取り出すことができます。成熟した(メタフェーズII)卵母細胞を得ることを目的としたホルモン刺激は、倫理的な問題と治療4に対する種および個々の特異的応答のためにヒトARTほど一般的ではない。
したがって、凍結保存戦略の開発は、通常、まれな個体の予期せぬまたは突然の死の後に取り出すことができる未熟なアテです。生物学的な観点から、未熟または成熟したアテの凍結保存にはいくつかの違いがあり、それぞれがその利点を有する。第一に、DNAは、胚芽小胞が核膜に囲まれた染色体を含む未熟な卵母細胞でより保護され、メタフェーズII卵母細胞のmeioticスピンドルは凍結傷害に対してより脆弱である可能性がある5。第二に、冷間誘発細胞骨格の損傷は、紡錘の回転、極体押出、前核移動およびサイトカネシスに影響を及ぼし、卵母細胞発生期に応じて異なる影響を及ぼし、微粉症の進行または受精後の事象に影響を及ぼす可能性がある。最後に、おそらく最も重要なのは、成熟した卵母細胞が受精する準備ができているのに対し、未熟なジマテは核および細胞質成熟6を通過するために周囲の積雲細胞の支持に依存しており、これが積雲母細胞複合体(COC)全体が凍結保存されている理由である。しかし、乳液細胞の喪失や、カテと周囲の体細胞との間の機能的なつながりの喪失は、おそらく未熟なCOCcの凍結保存の最も有害な影響である。
凍結保存技術の中でも、ガラス化は、フィールド条件でより容易に適用できるものです。低速(または制御速度)の凍結と比較して、ガラス化はより速く、プログラム可能な冷凍庫のような特定の装置を必要としない。ガラス化の三つの基本原則(すなわち、高粘度、高い凍結保護濃度、少量および超急速温度減少に結び付く)を満たすために、いくつかの媒体および支持剤は、特に未熟および成熟卵子の両方のために猫で開発され、使用されてきた。単純なストロー7から始まり、デバイスは「最小音量」目標に到達するために開発されました。クライオループ8、オープンプルストロー(OPS)9、プラスチック側溝(変性ストロー)10及びクライオチューブ11が用いられ、より効率的な装置(すなわち、クライオトップ)が採用されるまで、生存率及び明治を改善する。9クライオトップ(補足図1)は、ガラス化用の選択開放システムとなっている市販のサポートです。ヒト卵母細胞および胚のガラス化のために開発され、それは、貯蔵12の間にプラスチック管キャップによって保護された硬いプラスチックホルダーに取り付けられた小さなフィルムストリップからなる。ガラス化容積の極度の減少(わずか0.1μL)により、このガラス化サポートは、家庭用ネコを含む数種にますます適用され、様々なメディア13、14、15、16、17と共に使用されています。13,14,15,16,17
この原稿の目的は、実験室製のメディアと商業支援を用いて最小の体積ガラス化のために使用し、未熟なネコCOCの凍結保存のためのフィールド条件で容易に適用することができるヒト卵母細胞のために最初に開発されたものからのマイナーな変更を伴う、コレクションガラス化温暖化プロトコルを記述することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵母細胞凍結保存は、特にフェリダエ家のような多くの種が絶滅の危機に瀕しているタキサにおいて、重要な胚芽保護技術である。本稿では、未熟な猫卵母細胞のガラス化のためのシンプルで現場に優しいプロトコルが提示された。実験室製のメディア、最小体積ガラス化サポートおよび訓練を受けた人員は、この方法の成功のための重要な要因であり、この方法の成功の鍵となる要因であ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品の一部は、EVSSAR(欧州小動物生殖協会)グラント2016とミラノ大学、ピアノ・ディ・ソステグノ・アラ・リセルカ2019(リネア2アツィオーネA)によって支えられていました。また、マリアジョルジア・モルセリ博士がここに描かれた実験に貢献し、画像取得に貢献してくれたことに感謝したいと思います。
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
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