Minimum volumen vitrifikation af umodne Feline Oocytter
Summary
Dette manuskript beskriver en protokol for den mindste volumen vitrifikation af umodne kat oocytter med laboratorie-made medier på kommercielle støtter. Det dækker hvert skridt fra oocyt isolation fra ex vivo gonader til vitrifikation og opvarmning.
Abstract
I vilde dyr ‘bevarelse programmer, er gamet bankvirksomhed afgørende for at beskytte genetiske ressourcer af værdifulde individer og sjældne arter og for at fremme bevarelse af biodiversiteten. I felids, er de fleste arter truet af udryddelse, og indenlandske racer bruges som en model for at øge effektiviteten af protokoller for kimplasma bank. Blandt oocyt kryopræservering teknikker, vitrification er mere og mere populær i menneskers og veterinære assisteret reproduktion. Cryotop vitrifikation, som i første omgang blev udviklet til menneskelige oocytter og embryoner, har vist sig at være velegnet til kat oocytter. Denne metode giver flere fordele, såsom gennemførligheden i marken betingelser og hastigheden af proceduren, som kan være nyttige, når flere prøver skal behandles. Effektiviteten afhænger imidlertid i høj grad af operatørens færdigheder, og der er behov for standardisering inden for og på laboratoriet samt personaleuddannelse. Denne protokol beskriver minimum volumen vitrifikation af umodne katteoocytter på en kommerciel støtte i en trin for trin felt-venlige protokol, fra oocyt indsamling til opvarmning. Efter protokollen, bevarelse af oocyt integritet og levedygtighed ved opvarmning (så højt som 90%) kan forventes, selv om der stadig er plads til forbedringer i efteropvarmning modning og embryonale udvikling resultater.
Introduction
Kryopræservering er blevet et vigtigt trin i assisteret reproduktion teknikker (ARTs). Hos mennesker, det giver mulighed for bevarelse af frugtbarhed eller udsættelse af forældreskab af medicinske eller personlige årsager. Hos dyr er det nødvendigt at overvinde afstand og tid i planlagte parringer, især i husdyr og kæledyr, eller at bevare genetisk materiale af værdifulde emner i bevaringsprogrammer, især i vilde truede arter. Gamete kryopræservering er det bedste valg, når de personer, der skal opdrættes ikke er blevet valgt endnu, eller for at undgå etiske spørgsmål i forbindelse med embryo frysning, især i humanmedicin1. Spermatozoer er relativt nemme at bevare og give tilfredsstillende resultater efter optøning, men oocytter, på grund af deres strukturelle funktioner, kan være mere komplekse at opbevare. Faktisk, den lave overflade / volumen forholdet, samt tilstedeværelsen af zona pellucida omkring ooplasma, begrænser flytning af kryoprotektanter og vand på tværs afcellen 2. Desuden, i husdyr, herunder felids, de er kendetegnet ved en lipid-rige cytoplasma, som menes at gøre dem mere følsomme over for kryopræservering3.
De fleste felids er truet, og den indenlandske kat bruges som en model til at udvikle protokoller for germplasm bevarelse takket være tilgængeligheden af gonader fra rutinemæssig ovariektomi. Hos vilde dyr kan gonader fås efter elektive operationer eller (hyppigere) post mortem, og umodne (germinale vesikel) gameter kan hentes. Hormonel stimulation har til formål at opnå modne (metafase II) oocytter er ikke så almindeligt som i menneskelige ARTs på grund af de etiske spørgsmål og art- og individuel-specifikke svar på behandlinger4.
Derfor har udviklingen af kryopræserveringsstrategier fokuseret på umodne gametter, som normalt kan hentes efter sjældne individers uventede eller pludselige død. Fra et biologisk synspunkt, er der nogle forskelle i kryopræservering af umodne eller modne gameter, hver har sine fordele. For det første er DNA mere beskyttet i umodne oocytter, hvis germinale vesikel indeholder kromosomer omgivet af en nuklear membran, mens den meiotiske spindel af metafase II oocytter kunne være mere sårbar over for kryoinjuries5. For det andet, kold-induceret cytoskeleton skader kan påvirke spindel rotation, polære krop ekstrudering, pronuclear migration og cytokinese, som kan have forskellige virkninger i henhold til oocyt udviklingsmæssige fase, påvirker meiose progression eller post-befrugtning begivenheder. Endelig, og måske vigtigst af alt, mens modne oocytter er klar til at blive befrugtet, er umodne gameter afhængige af støtte fra de omkringliggende cumulus celler til at gå gennem nukleare og cytoplasmatisk modning6, og det er grunden til, at hele cumulus-oocyte komplekser (COCs) er cryopreserved. Men tabet af cumulus celler og / eller tab af funktionelle forbindelse mellem gamet og de omkringliggende somatiske celler er sandsynligvis den mest skadelige virkning af kryopræservering af umodne cocs.
Blandt kryopræservering teknikker, vitrification er en, der kan anvendes lettere i marken betingelser. Sammenlignet med langsom (eller kontrolleret hastighed) frysning, vitrification er hurtigere og kræver ikke specifikt udstyr, såsom en programmerbar fryser. For at opfylde de tre grundlæggende principper for vitrifikation (dvs. høj viskositet, forbundet med høj kryobeskyttende koncentration, små mængder og ultra-hurtig temperatur fald), flere medier og støtter især er blevet udviklet og anvendes i katte til både umodne og modne oocytter. Begyndende med simple sugerør7, enheder blev derefter udviklet til at nå “Minimum volumen” mål. Cryoloop8, åbne trukket sugerør (OPS)9, plast tagrender (modificeret halm)10 og cryotubes11 er blevet brugt, indtil en mere effektiv enhed (dvs. Cryotop) blevansat 11, forbedre overlevelse og meiose genoptagelse. Cryotop (Supplerende figur 1) er en kommercielt tilgængelig støtte, som er blevet det valgfrie åbne system til vitrifikation. Udviklet til vitrifikation af menneskelige oocytter og embryoner, den består af en lille filmstrimmel fastgjort til en hård plast holder, beskyttet af en plastrør hætte under opbevaring12. Takket være dens anvendelighed og den ekstreme reduktion i vitrifikation volumen (så lidt som 0,1 μL), hvilket også fører til ekstremt hurtig køling og opvarmning satser, denne vitrification støtte er i stigende grad blevet anvendt i flere arter, herunder den indenlandske kat, hvor det har været anvendt med en række medier13,14,15,16,17.
Formålet med dette manuskript er at beskrive en samling-vitrification-warming protokol, med mindre ændringer fra den oprindeligt udviklet til menneskelige oocytter, som beskæftiger laboratorie-made medier og kommercielle støtter for minimum volumen vitrification og kan let anvendes i marken betingelser for kryopræservering af umodne feline COCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyt kryopræservering er en afgørende germplasme bevarelse teknik, især i taxa, hvor mange arter er truede, såsom Felidae familie. I dette manuskript blev der fremlagt en enkel og feltvenlig protokol for vitrificering af umodne katteoocytter. Laboratoriemedier, understrætning af mindstevolumen og uddannet personale er nøglefaktorerne for denne metodes succes, som gør det muligt at opnå levedygtige oocytter konsekvent og gentagne gange, som det fremgår af de repræsentative resultater, der hermed rapporteres.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 og af Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi vil også gerne takke Dr. MariaGiorgia Morselli for hendes bidrag til de hermed afbildede eksperimenter og til billederhvervelse.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
