एक लागत प्रभावी और अनुकूलनीय स्क्रैच माइग्रेशन परख
Summary
हम खरोंच माइग्रेशन परख के लिए एक लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं जो उपकरण-गहन तरीकों के उपयोग के बिना सेल माइग्रेशन का निर्धारण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग किया गया था, इसे सेल माइग्रेशन पर अतिरिक्त सेल प्रकारों और प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित और उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
सेल माइग्रेशन शारीरिक और पैथोलॉजिकल दोनों घटनाओं में एक प्रमुख घटक है। सामान्य सेल माइग्रेशन विकास और बढ़ते प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जैसे आवश्यक कार्यों के लिए आवश्यक है। जब सेल माइग्रेशन प्रक्रिया के साथ कोई दोष या परिवर्तन होता है, तो इसके हानिकारक परिणाम हो सकते हैं (यानी, कैंसर मेटास्टेसिस, घाव भरने और निशान गठन)। सेल माइग्रेशन के महत्व के कारण, सेल माइग्रेशन परख तक पहुंच होना आवश्यक है जो सस्ती, अनुकूलनीय और दोहराने योग्य है। आम खरोंच प्रवास परख का उपयोग करते हुए, हमने कोशिका प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण विकसित किया है जो सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है। वर्णित विधि दृश्य मार्कर का उपयोग करती है जो समय-चूक माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को फिर से कब्जा करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह प्रायोगिक डिजाइन में लचीलापन प्रदान करता है, माइग्रेशन मैट्रिक्स सब्सट्रेट में फेरबदल करने से लेकर औषधीय संशोधकों के अलावा । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन के क्षेत्र के लिए खाते में जाने का एक तरीका रेखांकित करता है, जिसे सेल माइग्रेशन की जांच करते समय कई तरीकों से नहीं माना जाता है। यह नया दृष्टिकोण एक बड़े दर्शकों के लिए एक खरोंच प्रवास परख प्रदान करता है और शोधकर्ताओं को सेल माइग्रेशन के शारीरिक और रोगविज्ञानी प्रभाव की जांच करने के लिए अधिक अवसर प्रदान करेगा।
Introduction
सेल माइग्रेशन कई शारीरिक और साथ ही रोग की घटनाओं के लिए महत्वपूर्ण है। यह विकास के दौरान, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ाने के लिए, और उचित घाव भरने के लिए आवश्यक है1,2,3। इनमें से कई सेल माइग्रेशन इवेंट्स को भौतिक या रासायनिक संकेतों से ट्रिगर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, ल्यूकोसाइट्स एक केमोटाट्रेक्टेंट2के जवाब में चोट की साइट की ओर प्रवास करेंगे। इसके अतिरिक्त, ल्यूकोसाइट्स अतिरिक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास को प्रेरित करने के लिए साइटोकिन्स भी जारी करेंगे, साथ ही फाइब्रोब्लास्ट जैसे अन्य सेल प्रकार, जो घाव भरने की प्रक्रिया में शामिल हैं, और इस प्रकार, एक बहुकोशिकीय प्रतिक्रिया4शुरू करेंगे। कोशिकाओं को माइग्रेट करने की क्षमता उचित शारीरिक कार्य के लिए आवश्यक है; हालांकि, जब सेल माइग्रेशन अनियंत्रित हो जाता है, तो इसकी प्रतिकूल प्रतिक्रिया हो सकती है और पुरानी सूजन, संवहनी रोग, कैंसर मेटास्टेसिस, और बिगड़ा घावउपचार2,3,4,5,6,7जैसी रोग की घटनाओं में योगदान देसकताहै। बिगड़ा घाव उपचार कोशिका प्रवास में दोषों के कारण मधुमेह रोगियों का एक आम दुःख है, और यदि इन दोषों को दूर नहीं किया जाता है, तो यह आगे की जटिलताओं (जैसे, विच्छेदन8,9)का कारण बन सकता है। इस अध्ययन के साथ-साथ अन्य लोगों ने इस प्रक्रिया को और अधिक समझने की आवश्यकता का संकेत दिया है जिसके द्वारा कोशिका प्रवास होता है, या तो सामान्य शारीरिक या रोग की स्थिति में, और अनुसंधान के इस क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए यह महत्वपूर्ण है । आदेश में इस को पूरा करने के लिए, वहां के लिए उपलब्ध प्रवास परख की जरूरत है कि दोनों सुलभ और उन शोधकर्ताओं, जो इन परख का संचालन करने के लिए आवश्यक उपकरण के अधिकारी नहीं हो सकता है के लिए सस्ती हैं ।
वर्तमान में, सेल माइग्रेशन के बारे में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए विभिन्न प्रकार के माइग्रेशन परख उपलब्ध हैं। 2डी और 3डी माइग्रेशन दोनों मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें से प्रत्येक सेल माइग्रेशन को प्रभावित करने वाले विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करता है। 3डी माइग्रेशन मॉडल आमतौर पर सेल आक्रमण अध्ययनों से जुड़े होते हैं और सेल माइग्रेशन10, 11,12पर एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के प्रभाव का आकलन करते हैं, जबकि2डीमाइग्रेशन परख में आवेदन की एक बड़ी श्रृंखला होती है और मुख्य रूप से सेल माइग्रेशन13,14, 15,16के दौरान केमोटेक्टिक माइग्रेशन, घाव भरने और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। इनमें से कई परख के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि बॉयडन चैम्बर्स या अपवर्जन के छल्ले, जो कुछ शोधकर्ताओं को इन परख की उपलब्धता को कम कर सकते हैं। अधिक लागत-कुशल परख में से एक खरोंच परख है, जिसका उपयोग आमतौर पर कोशिका प्रवास14, 17में घाव भरने और सामान्य परिवर्तनों का आकलन करने के लिए कियाजाताहै। जबकि अधिकांश प्रयोगशालाओं को खरोंच परख का संचालन करने के लिए सुसज्जित किया जाता है, सेल माइग्रेशन को ट्रैक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण या तो अनुपलब्ध होते हैं या खरीदने के लिए बहुत महंगे होते हैं। इसमें टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी शामिल है, जिसके लिए उल्टे माइक्रोस्कोप और लाइव इमेजिंग सिस्टम की जरूरत होती है । उपकरणों के ये महंगे टुकड़े आमतौर पर हर प्रयोगशाला के लिए सुलभ नहीं हैं। इसलिए, यह अवलोकन एक नए प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है जो अधिक आसानी से उपलब्ध उपकरणों के साथ सेल माइग्रेशन के आकलन की अनुमति देता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए एक नया और किफायती तरीका प्रदान करता है। यह विधि स्क्रैच परख से जुड़ी एक ही प्रक्रिया का पालन करती है लेकिन एक बुनियादी विज्ञान प्रयोगशाला सेटिंग में अधिक सामान्यतः उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके सेल माइग्रेशन की जांच के विश्लेषण में भिन्न होती है। सामान्य उपकरणों का उपयोग करने वाला यह प्रोटोकॉल समय-चूक माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना सेल माइग्रेशन के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। माइग्रेशन का निर्धारण करने के अलावा, यह विधि स्क्रैच क्षेत्र में चर कारकों के लिए भी खाता है जिसे सेल माइग्रेशन को बहुत प्रभावित करने के लिए नोट किया गया है। कुल मिलाकर, सेल माइग्रेशन विश्लेषण के लिए यह नया प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन के क्षेत्र में अधिक प्रयोगशालाओं का पता लगाने और योगदान करने का अवसर प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
खरोंच प्रवास परख के लिए यह नया दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए सेल प्रवास में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक और अधिक सुलभ विधि प्रदान करता है । हालांकि यह परख अन्य खरोंच परख के समान खरोंच के प्रशासन के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार #81XWH-16-1-0710, मिसिसिपी स्कूल ऑफ फार्मेसी विश्वविद्यालय और बायोमॉलिक्यूलर साइंसेज विभाग द्वारा समर्थित है।
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
