Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest
Summary
We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.
Abstract
Celmigratie is een belangrijke component in zowel fysiologische als pathologische gebeurtenissen. Normale celmigratie is vereist voor essentiële functies zoals ontwikkeling en het monteren van een immuunrespons. Wanneer een defect of wijziging optreedt met het celmigratieproces, kan het schadelijke resultaten hebben (d.w.z. kankermetastase, wondgenezing en littekenvorming). Vanwege het belang van celmigratie is het noodzakelijk om toegang te hebben tot een celmigratietest die betaalbaar, aanpasbaar en herhaalbaar is. Met behulp van de gemeenschappelijke scratch migratie test, hebben we een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het analyseren van celmigratie die algemene laboratoriumapparatuur gebruikt. De beschreven methode maakt gebruik van visuele markers die het mogelijk maken om specifieke interessegebieden te heroveren zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Daarnaast biedt het flexibiliteit in het experimentele ontwerp, variërend van het veranderen van het migratiematrijssubstraat tot de toevoeging van farmacologische modifiers. Bovendien schetst dit protocol een manier om rekening te houden met het gebied van celmigratie, dat niet door verschillende methoden wordt beschouwd bij het onderzoeken van celmigratie. Deze nieuwe aanpak biedt een scratch migratie test aan een groter publiek en biedt onderzoekers meer mogelijkheden om de fysiologische en pathofysiologische impact van celmigratie te onderzoeken.
Introduction
Celmigratie is cruciaal voor veel fysiologische en pathologische gebeurtenissen. Het is nodig tijdens de ontwikkeling, voor het monteren van een immuunrespons, en voor een goede wondgenezing1,2,3. Veel van deze celmigratiegebeurtenissen kunnen worden veroorzaakt door fysieke of chemische signalen. Bijvoorbeeld, tijdens een immuunrespons, leukocyten zal migreren naar een site van letsel in reactie op een chemoattractant2. Daarnaast zullen leukocyten ook cytokines vrijgeven om migratie van extra immuuncellen te induceren, evenals andere celtypen, zoals fibroblasten, die betrokken zijn bij het wondgenezingsproces, en dus een meercellige respons4in werking treden. Het vermogen van cellen om te migreren is essentieel voor een goede fysiologische functie; wanneer de celmigratie echter ongecontroleerd blijft, kan deze een negatieve respons hebben en bijdragen tot pathologische voorvallen, zoals chronische ontsteking, vasculaire ziekte, metastase van kanker en verminderde wondgenezing2,3,4,5,6,7. Verminderde wondgenezing is een veel voorkomende aandoening van diabetici als gevolg van defecten in celmigratie, en als deze gebreken niet worden aangepakt, kan dit leiden tot verdere complicaties (bijvoorbeeld amputatie8,9). Deze studie, evenals anderen, hebben aangegeven dat het proces waarbij celmigratie plaatsvindt verder moet worden begrepen, hetzij onder normale fysiologische of pathologische omstandigheden, en het is van vitaal belang om dit onderzoeksgebied te bevorderen. Om dit te bereiken, moeten er migratietesten beschikbaar zijn die zowel toegankelijk als betaalbaar zijn voor die onderzoekers, die mogelijk niet over de apparatuur beschikken die nodig is om deze tests uit te voeren.
Momenteel zijn er verschillende migratietesten beschikbaar om een breed scala aan onderwerpen met betrekking tot celmigratie te onderzoeken. Zowel 2D- als 3D-migratiemodellen zijn ontwikkeld, die zich richten op specifieke gebieden die van invloed zijn op celmigratie. 3D-migratiemodellen worden doorgaans geassocieerd met celinvasiestudies en beoordelen de impact van extracellulaire matrix op celmigratie10,11,12, terwijl 2D-migratietesten een groter toepassingsgebied hebben en voornamelijk worden gebruikt om chemotactische migratie, wondgenezing en functionele veranderingen te bestuderen tijdens celmigratie13,14,15,16. Een aantal van deze tests vereisen extra apparatuur, zoals Boyden kamers of uitsluiting ringen, die de beschikbaarheid van deze tests voor bepaalde onderzoekers kan verminderen. Een van de meer kostenefficiënte testen is de scratch-test, die meestal wordt gebruikt om wondgenezing en algemene veranderingen in celmigratie14,17te beoordelen . Terwijl de meeste laboratoria zijn uitgerust om een krastest uit te voeren, de apparatuur die wordt gebruikt om celmigratie te volgen hebben de neiging om ofwel niet beschikbaar of te duur om te kopen. Dit omvat time-lapse microscopie, die een omgekeerde microscoop en een live imaging systeem vereist. Deze dure apparaten zijn niet algemeen toegankelijk voor elk laboratorium. Daarom benadrukt deze observatie de noodzaak van een nieuw protocol dat de beoordeling van celmigratie met gemakkelijker beschikbare apparatuur mogelijk maakt.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe en betaalbare manier om celmigratie te beoordelen. Deze methode volgt dezelfde procedure in verband met krastesten, maar verschilt in de analyse van het onderzoeken van celmigratie door gebruik te maken van apparatuur die vaker beschikbaar is in een laboratoriumomgeving voor basiswetenschappen. Dit protocol met behulp van gemeenschappelijke apparatuur zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van celmigratie zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Naast het bepalen van migratie, is deze methode ook verantwoordelijk voor variabele factoren in het krasgebied waarvan is opgemerkt dat deze een grote impact heeft op celmigratie. Over het algemeen biedt dit nieuwe protocol voor celmigratieanalyse de mogelijkheid voor meer laboratoria om te verkennen en bij te dragen aan het gebied van celmigratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze nieuwe benadering van de scratch migratie test biedt een meer toegankelijke methode voor onderzoekers om veranderingen in celmigratie te onderzoeken. Hoewel deze test volgt dezelfde procedure voor het beheer van een kras vergelijkbaar met andere krastesten, het biedt wel een nieuwe methode voor beeldvorming en nauwkeurige analyse van celmigratie10. In plaats van apparatuur-intensieve methoden van time-lapse microscopie en live cel beeldvorming kamers, deze methode details het gebruik van alge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy en het Department of BioMolecular Sciences.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
