هجرة خدش فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف
Summary
نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لجراتش الهجرة التي توفر نهجا جديدا لتحديد هجرة الخلايا دون استخدام أساليب مكثفة المعدات. في حين تم استخدام الخلايا الليفية في هذا البروتوكول، يمكن تكييفها واستخدامها لدراسة أنواع الخلايا الإضافية والتأثيرات على ترحيل الخلايا.
Abstract
تعد هجرة الخلايا مكونًا أساسيًا في الأحداث الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. مطلوب ترحيل الخلايا العادية لوظائف أساسية مثل تطوير وتركيب استجابة مناعية. عندما يحدث خلل أو تغيير مع عملية هجرة الخلية ، يمكن أن يكون له نتائج ضارة (أي الانبثاث السرطاني ، والتئام الجروح ، وتشكيل الندبة). نظرا لأهمية هجرة الخلايا، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى خلية الهجرة فحص بأسعار معقولة، والتكيف، وتكرار. الاستفادة من اختبار الهجرة الصفر المشتركة، وضعنا نهجا جديدا لتحليل الهجرة الخلية التي تستخدم معدات المختبرات العامة. تستخدم الطريقة الموصوفة علامات بصرية تسمح باستعادة مناطق محددة ذات أهمية دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر المرونة في التصميم التجريبي، بدءا من تغيير الركيزة مصفوفة الهجرة إلى إضافة المعدلات الدوائية. وعلاوة على ذلك، يحدد هذا البروتوكول طريقة لحساب منطقة ترحيل الخلايا، والتي لا يتم اعتبارها من قبل عدة طرق عند فحص ترحيل الخلايا. يقدم هذا النهج الجديد اختبارًا للهجرة الصفرية لجمهور أكبر وسيتيح فرصة أكبر للباحثين لفحص التأثير الفسيولوجي والفيزيولوجي لهجرة الخلايا.
Introduction
تعد هجرة الخلايا أمرًا حاسمًا للعديد من الأحداث الفسيولوجية وكذلك المرضية. وهو مطلوب أثناء التطوير ، لتركيب استجابة مناعية ، ولتضميد الجروح المناسبة1،2،3. ويمكن أن يتم تشغيل العديد من هذه الأحداث الهجرة الخلية عن طريق الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية. على سبيل المثال، أثناء الاستجابة المناعية، سوف تنتقل الكريات البيض نحو موقع الإصابة استجابة لـ2. بالإضافة إلى ذلك، الكريات البيض سوف تطلق أيضا السيتوكينات للحث على الهجرة من الخلايا المناعية إضافية، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، التي تشارك في عملية التئام الجروح، وبالتالي، بدء استجابة متعددة الخلايا4. قدرة الخلايا على الهجرة ضرورية لوظيفة فسيولوجية مناسبة; ومع ذلك ، عندما يذهب هجرة الخلايا دون رادع ، يمكن أن يكون لها استجابة سلبية وتساهم في الأحداث المرضية ، مثل الالتهاب المزمن ، وأمراض الأوعية الدموية ، ونقائل السرطان ، وضعف التئام الجروح2،3،4،5،6،7. التئام الجروح الضعيفة هي إصابة شائعة لمرضى السكري بسبب عيوب في هجرة الخلايا ، وإذا لم يتم معالجة هذه العيوب ، فقد يؤدي ذلك إلى مزيد من المضاعفات (على سبيل المثال ، بتر8،9). وقد أشارت هذه الدراسة، فضلا عن غيرها، إلى الحاجة إلى زيادة فهم العملية التي تحدث بها هجرة الخلايا، إما في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية العادية، وهي حيوية لتعزيز هذا المجال من البحوث. ولتحقيق ذلك، يجب أن تكون هناك مقايسات للهجرة متاحة يمكن الوصول إليها وبتكلفة معقولة للباحثين، الذين قد لا يمتلكون المعدات اللازمة لإجراء هذه الأقوال.
حاليا، هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الهجرة المتاحة لدراسة مجموعة واسعة من المواضيع المتعلقة بهجرة الخلايا. وقد تم تطوير كلا من نموذجي الهجرة 2D و 3D، كل منهما يستهدف مناطق محددة تؤثر على هجرة الخلايا. ترتبط نماذج الهجرة ثلاثية الأبعاد عادةً بدراسات غزو الخلايا وتقييم تأثير المصفوفة خارج الخلية على هجرة الخلايا10،11،12، في حين أن مقايسات الهجرة 2D لديها نطاق أكبر من التطبيق وتستخدم في المقام الأول لدراسة الهجرة الكيميائية ، والتئام الجروح ، والتغيرات الوظيفية أثناء هجرة الخلايا13،14،15،16. العديد من هذه المقايسات تتطلب معدات إضافية، مثل غرف بويدن أو حلقات الاستبعاد، والتي يمكن أن تقلل من توافر هذه المقايسات لبعض الباحثين. واحدة من أكثر فعالية من حيث التكلفة المقايسات هو الخدش المقايسة، والذي يستخدم عادة لتقييم التئام الجروح والتغيرات العامة في هجرة الخلايا14،17. وفي حين أن معظم المختبرات مجهزة لإجراء فحص الخدش، فإن المعدات المستخدمة لتتبع هجرة الخلايا تميل إلى أن تكون إما غير متوفرة أو مكلفة للغاية لا يمكن شراؤها. وهذا يشمل المجهر الفاصل الزمني، الذي يتطلب مجهر مقلوب ونظام تصوير حي. هذه القطع باهظة الثمن من المعدات ليست متاحة عادة لكل مختبر. ولذلك، تبرز هذه الملاحظة الحاجة إلى بروتوكول جديد يسمح بتقييم هجرة الخلايا بمعدات أكثر سهولة.
البروتوكول المعروض هنا يوفر طريقة جديدة وبأسعار معقولة لتقييم ترحيل الخلايا. ويتبع هذا الأسلوب نفس الإجراء المرتبط بمجرّدات الخدش ولكنه يختلف في تحليل فحص هجرة الخلايا باستخدام معدات أكثر شيوعًا متوفرة في بيئة مختبرية للعلوم الأساسية. يسمح هذا البروتوكول باستخدام المعدات الشائعة بتحديد أكثر دقة لترحيل الخلايا دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. بالإضافة إلى تحديد الترحيل، هذه الطريقة أيضاً مسؤولة عن عوامل متغيرة في منطقة الخدش التي تم ملاحظتها إلى تأثير كبير على ترحيل الخلايا. وعموما، فإن هذا البروتوكول الجديد لتحليل هجرة الخلايا يتيح فرصة لمزيد من المختبرات لاستكشاف مجال هجرة الخلايا والمساهمة في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا النهج الجديد لاختبار الهجرة الصفر يوفر وسيلة أكثر سهولة للباحثين لدراسة التغيرات في هجرة الخلايا. في حين أن هذا الفحص يتبع نفس الإجراء لإدارة خدش مشابه لتشاتد الخدوش الأخرى ، فإنه يوفر طريقة جديدة للتصوير والتحليل الدقيق لهجرة الخلايا10. بدلاً من استخدام أساليب مكثفة الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث الطبية للجيش الأمريكي #81XWH-16-1-0710، جامعة ميسيسيبي كلية الصيدلة وقسم العلوم الحيوية.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
