Un test de migration à gratter rentable et adaptable
Summary
Nous présentons une méthode rentable à l’essai de migration de rayures qui fournit une nouvelle approche pour déterminer la migration cellulaire sans l’utilisation de méthodes à forte intensité d’équipement. Bien que les fibroblastes aient été utilisés dans ce protocole, ils peuvent être adaptés et utilisés pour étudier d’autres types de cellules et influences sur la migration cellulaire.
Abstract
La migration cellulaire est un élément clé des événements physiologiques et pathologiques. La migration cellulaire normale est nécessaire pour les fonctions essentielles telles que le développement et le montage d’une réponse immunitaire. Lorsqu’un défaut ou une altération se produit avec le processus de migration cellulaire, il peut avoir des conséquences néfastes (c.-à-d. métastase du cancer, cicatrisation des plaies et formation de cicatrices). En raison de l’importance de la migration cellulaire, il est nécessaire d’avoir accès à un test de migration cellulaire abordable, adaptable et reproductible. En utilisant l’analyse commune de migration des rayures, nous avons développé une nouvelle approche pour analyser la migration cellulaire qui utilise l’équipement de laboratoire général. La méthode décrite utilise des marqueurs visuels qui permettent de reprendre des domaines d’intérêt spécifiques sans l’utilisation de la microscopie en accéléré. En outre, il offre une flexibilité dans la conception expérimentale, allant de la modification du substrat de la matrice de migration à l’ajout de modificateurs pharmacologiques. En outre, ce protocole décrit un moyen de rendre compte de la zone de migration cellulaire, qui n’est pas prise en compte par plusieurs méthodes lors de l’examen de la migration cellulaire. Cette nouvelle approche offre un test de migration à gratter à un public plus large et offrira aux chercheurs une plus grande occasion d’examiner l’impact physiologique et pathophysiologique de la migration cellulaire.
Introduction
La migration cellulaire est cruciale pour de nombreux événements physiologiques et pathologiques. Il est nécessaire pendant le développement, pour monter une réponse immunitaire, et pour la guérison appropriée deblessure 1,2,3. Bon nombre de ces événements de migration cellulaire peuvent être déclenchés par des signaux physiques ou chimiques. Par exemple, au cours d’une réponse immunitaire, les leucocytes migreront vers un site de blessures en réponse à un chimioattractant2. En outre, les leucocytes libéreront également des cytokines pour induire la migration des cellules immunitaires additionneuses, aussi bien que d’autres types de cellules, tels que des fibroblastes, qui sont impliqués dans le processus de guérison de blessure, et ainsi, initiant une réponse multicellulaire4. La capacité des cellules à migrer est essentielle pour une fonction physiologique appropriée; cependant, quand la migration cellulaire passe inaperçue, elle peut avoir une réponse défavorable et contribuer aux événements pathologiques, tels que l’inflammation chronique, la maladie vasculaire, la métastase de cancer, et la guérison altérée deblessure 2,3,4,5,6,7. La cicatrisation altérée des plaies est une affection courante chez les diabétiques en raison de défauts dans la migration cellulaire, et si ces défauts ne sont pas pris en compte, elle pourrait entraîner d’autres complications (p. ex., amputation8,9). Cette étude, ainsi que d’autres, ont indiqué la nécessité de mieux comprendre le processus par lequel la migration cellulaire se produit, soit dans des conditions physiologiques ou pathologiques normales, et il est vital pour faire avancer ce domaine de recherche. Pour ce faire, il doit y avoir des analyses de migration disponibles qui sont à la fois accessibles et abordables pour les chercheurs, qui peuvent ne pas posséder l’équipement nécessaire pour effectuer ces analyses.
À l’heure actuelle, il existe une variété d’analyses migratoires disponibles pour examiner un large éventail de sujets concernant la migration cellulaire. Des modèles de migration 2D et 3D ont été développés, chacun ciblant des zones spécifiques impactant la migration cellulaire. Les modèles de migration 3D sont généralement associés à des études d’invasion cellulaire et évaluent l’impact de la matrice extracellulaire sur la migrationcellulaire 10,11,12, tandis que les tests de migration 2D ont une plus grande gamme d’application et sont principalement utilisés pour étudier la migration chimoactique, la cicatrisation des plaies et les changements fonctionnels pendant la migrationcellulaire 13,14,15,16. Plusieurs de ces analyses nécessitent de l’équipement supplémentaire, comme des chambres Boyden ou des anneaux d’exclusion, ce qui peut réduire la disponibilité de ces tests pour certains chercheurs. Un des analyses les plus rentables est l’analyse à gratter, qui est généralement utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies et les changements généraux dans la migrationcellulaire 14,17. Bien que la plupart des laboratoires soient équipés pour effectuer un test d’éraflure, l’équipement utilisé pour suivre la migration cellulaire a tendance à être indisponible ou trop coûteux à acheter. Cela inclut la microscopie en accéléré, qui nécessite un microscope inversé et un système d’imagerie en direct. Ces pièces d’équipement coûteuses ne sont pas couramment accessibles à tous les laboratoires. Par conséquent, cette observation souligne la nécessité d’un nouveau protocole qui permette l’évaluation de la migration cellulaire avec un équipement plus facilement disponible.
Le protocole présenté ici fournit un moyen nouveau et abordable d’évaluer la migration cellulaire. Cette méthode suit la même procédure associée aux essais à gratter, mais diffère dans l’analyse de l’examen de la migration cellulaire en utilisant l’équipement plus couramment disponible dans un laboratoire de sciences fondamentales. Ce protocole utilisant l’équipement commun permet une détermination plus précise de la migration cellulaire sans l’utilisation de la microscopie time-lapse. En plus de déterminer la migration, cette méthode explique également les facteurs variables dans la zone d’éraflure qui a été noté pour avoir un impact considérable sur la migration cellulaire. Dans l’ensemble, ce nouveau protocole d’analyse de la migration cellulaire offre à un plus grand nombre de laboratoires l’occasion d’explorer et de contribuer au domaine de la migration cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette nouvelle approche de l’analyse de la migration des rayures offre aux chercheurs une méthode plus accessible pour examiner les changements dans la migration cellulaire. Bien que cet essai suive la même procédure pour administrer une égratignure semblable à d’autres analyses de rayures, il fournit une nouvelle méthode pour l’imagerie et l’analyse précise de la migration cellulaire10. Au lieu d’utiliser des méthodes intensives d’équipement de microscopie en accéléré et d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux sont appuyés par le Us Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, l’École de pharmacie de l’Université du Mississippi et le Département des sciences biomoléculaires.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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