Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.
Abstract
As principais complicações associadas com stents metálicos nus e stents de eluição de drogas são restenose de stent e trombose do stent tardio, respectivamente. Assim, melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos continua sendo um desafio significativo. O objetivo deste protocolo é descrever uma técnica robusta de modificação da superfície metálica por peptídeos biologicamente ativos para aumentar a biocompatibilidade de implantes médicos de contato sanguíneo, incluindo stents endovasculares. CD47 é um marcador de auto-doença específico de espécies imunológicas e tem propriedades anti-inflamatórias. Estudos mostraram que um peptídeo de 22 aminoácidos correspondente ao domínio Ig de CD47 na região extracelular (pepCD47), tem propriedades anti-inflamatórias como a proteína de comprimento total. Estudos in vivo em ratos, e estudos ex vivo em sistemas experimentais de coelhos e sangue humanos do nosso laboratório demonstraram que a imobilização pepCD47 em metais melhora sua biocompatibilidade, impedindo a fixação e ativação de células inflamatórias. Este artigo descreve o protocolo passo a passo para a funcionalização de superfícies metálicas e acessório de peptídeo. As superfícies metálicas são modificadas usando bisfosfato de poliallavina com grupos de tiol latente (PABT), seguidos de desproteção de tiais e amplificação de sítios de tiol-reativos via reação com polietileneimina instalada com grupos piridyldithio (PEI-PDT). Finalmente, pepCD47, incorporando resíduos de cisteína terminal conectados à sequência de peptídeos do núcleo através de um espaçador duplo 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, são anexados à superfície metálica através de ligações de dissulfeto. Esta metodologia de apego de peptídeo à superfície metálica é eficiente e relativamente barata e, portanto, pode ser aplicada para melhorar a biocompatibilidade de vários biomateriais metálicos.
Introduction
A intervenção coronária percutânea é a primeira linha de terapia para tratar doenças da artéria coronária (CAD) e envolve principalmente o stent das artérias doentes. No entanto, a restenose do stent (ISR) e a trombose do stent são complicações comuns associadas à implantação do stent1. A interação sanguínea na interface sangue-stent é caracterizada por uma adsorção quase imediata de proteínas plasmáticas na superfície metálica, seguida por apego e ativação celular plaquetária e inflamatória2. A liberação das citocinas inflamatórias e quimiocinas de células inflamatórias ativadas leva à modificação fenotípica das células musculares lisas vasculares (VSMCs) na mídia tunica e desencadeia sua migração centrípeta para o compartimento intimal. A proliferação de VSMC ativado na intimação resulta em espessamento de camada intimal, estreitamento do lúmen e restenose in-stent3. Os stents de eluição de drogas (DES) foram desenvolvidos para evitar a proliferação do VSMC; no entanto, essas drogas têm um efeito citotóxico fora do alvo nas células endoteliais4,5. Portanto, trombose do stent tardio é uma complicação comum associada ao DES6,7. Stents feitos de polímeros biodegradáveis, como o poli-L-lactide, mostraram muita promessa nos experimentos animais e ensaios clínicos iniciais, mas acabaram sendo lembrados quando o uso clínico “da vida real” demonstrou sua inferioridade à3ª geração do DES8. Portanto, é necessário melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos nus para melhores resultados do paciente.
CD47 é uma proteína transmembrana onipresentemente expressa que inibe a resposta imune inata quando vinculada ao seu receptor cognato Signal Regulatory Protein alfa (SIRPα)9. O receptor SIRPα possui um motivo inibidor de tyrosina de células imunes (ITIM) e os eventos de sinalização sobre a interação SIRPα – CD47 acabam resultando na queda da ativação celular inflamatória10,,11,,12,13. Pesquisas em nosso laboratório mostraram que cd47 recombinante ou seu derivado peptídeo, correspondente ao domínio de 22 aminoácidos Ig da região extracelular de CD47 (pepCD47), pode reduzir a resposta imune do hospedeiro a uma gama de biomateriais clinicamente relevantes14,,15,,16. Recentemente, demonstramos que o pepCD47 pode ser imobilizado para superfícies de stent de aço inoxidável e reduzir significativamente a resposta fisiopatológica associada à restenose. Note-se que as superfícies modificadas pepCD47 são favoráveis a condições de uso relevantes, como armazenamento a longo prazo e esterilização de óxido de etileno17. Para isso, o pepCD47 pode ser um alvo terapêutico útil para lidar com as limitações clínicas dos stents endovasculares.
A estratégia para a fixação covalente de pepCD47 a uma superfície metálica envolve uma série de novas modificações químicas da superfície metálica. As superfícies metálicas são primeiro revestidas com bisfosfonato de poliallavina com grupos de tiol latentes (PABT), seguidos pela desproteção dos tiols e apego da polietileneimina (PEI) com grupos piridyldithio instalados (PDT). Grupos de PDT de PEI não consumidos na reação com thiols PABT desprotegidos são então reagidos com pepCD47 incorporando thiols nos resíduos de cisteína terminal, resultando em pepCD47 de ligação à superfície metálica através de uma ligação de dissulfeto14,,17,18. Utilizamos um pepCD47 conjugado fluoróforo (TAMRA-pepCD47) para determinar a concentração de entrada de peptídeo que resulta na imobilização máxima da superfície do peptídeo. Finalmente, avaliamos a capacidade anti-inflamatória aguda e crônica das superfícies metálicas revestidas de pepCD47, ex vivo, utilizando o aparelho de loop Chandler, e o ensaio de expansão de apego/macrófago monócito/ macrófago, respectivamente.
Este artigo fornece um protocolo sistemático para a fixação de peptídeos tiaolados à superfície metálica; determinando a densidade máxima de imobilização do peptídeo; e avaliando as propriedades anti-inflamatórias das superfícies metálicas revestidas pepCD47 expostas a sangue inteiro e monócitos isolados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstramos e descrevemos uma estratégia química relativamente nova para anexar moieties de peptídeos terapêuticos a uma superfície de aço inoxidável com o objetivo abrangente de reduzir a reatividade da superfície com células inflamatórias encontradas no sangue. A química de bisfosfonato aqui descrita envolve a formação de vínculos coordenados entre os óxidos metálicos e os grupos de bisfosfonato de PABT. A espessura da monocamada de polifosfosfonato formada na superfície metálica não excede 5 nm<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento de protocolos e estudos apresentados neste artigo foram apoiados pelo financiamento do NIH (NBIB) R01 (# EB023921) para IF e SJS, e financiamento do NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) para IF e RJL.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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