Summary
Aquí se presenta un protocolo para añadir péptido CD47 (pepCD47) a stents metálicos utilizando la química de polibisfosfonato. La funcionalización de los stents metálicos mediante pepCD47 evita la unión y activación de las células inflamatorias mejorando así su biocompatibilidad.
Abstract
Las complicaciones clave asociadas con los stents de metal desnudo y los stents eluyentes de fármacos son la restenosis en stent y la trombosis tardía del stent, respectivamente. Por lo tanto, la mejora de la biocompatibilidad de los stents metálicos sigue siendo un desafío importante. El objetivo de este protocolo es describir una técnica robusta de modificación de la superficie metálica mediante péptidos biológicamente activos para aumentar la biocompatibilidad de los implantes médicos que contactan con la sangre, incluidos los stents endovasculares. CD47 es un marcador inmunológico específico de especies de sí mismo y tiene propiedades antiinflamatorias. Los estudios han demostrado que un péptido de 22 aminoácidos correspondiente al dominio Ig de CD47 en la región extracelular (pepCD47), tiene propiedades antiinflamatorias como la proteína de longitud completa. Estudios in vivo en ratas, y estudios ex vivo en sistemas experimentales de sangre humana y conejo de nuestro laboratorio han demostrado que la inmovilización pepCD47 en metales mejora su biocompatibilidad al prevenir la unión y activación de células inflamatorias. Este artículo describe el protocolo paso a paso para la funcionalización de superficies metálicas y fijación de péptidos. Las superficies metálicas se modifican utilizando bisfosfato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de desprotección de tioles y amplificación de sitios tiol-reactivos a través de la reacción con polietilenimina instalada con grupos de piridildithio (PEI-PDT). Por último, pepCD47, que incorpora residuos terminales de cisteína conectados a la secuencia de péptidos del núcleo a través de un espaciador dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, se unen a la superficie metálica a través de enlaces de disulfuro. Esta metodología de fijación de péptidos a la superficie metálica es eficiente y relativamente económica y, por lo tanto, se puede aplicar para mejorar la biocompatibilidad de varios biomateriales metálicos.
Introduction
La intervención coronaria percutánea es la primera línea de terapia para tratar las enfermedades de las arterias coronarias (CAD) y consiste principalmente en stentar las arterias enfermas. Sin embargo, la restenosis in-stent (ISR) y la trombosis de stent son complicaciones comunes asociadas con el despliegue de stent1. La interacción sanguínea en la interfaz de la sangre-stent se caracteriza por una adsorción casi inmediata de proteínas plasmáticas en la superficie metálica, seguida de la unión plaquetaria y celular inflamatoria y la activación2. La liberación de las citoquinas inflamatorias y quimioquinas de las células inflamatorias activadas conduce a la modificación fenotípica de las células musculares lisas vasculares (VSMC) en los medios de la túnica y desencadena su migración centrípeta al compartimento intimal. La proliferación de VSMC activado en la intima da como resultado un engrosamiento de la capa intimal, estrechamiento de lúmenes y restenosis in-stent3. Se desarrollaron stents de elución de fármacos (DES) para prevenir la proliferación de VSMC; sin embargo, estos medicamentos tienen un efecto citotóxico fuera de la diana en las células endoteliales4,5. Por lo tanto, la trombosis tardía del stent es una complicación común asociada con DES6,,7. Los stents hechos de polímeros biodegradables, como el poli-L-lactide han demostrado mucha promesa en los experimentos con animales y los ensayos clínicos iniciales, pero finalmente fueron recordados cuando el uso clínico "de la vida real" demostró su inferioridad a la3a generación DES8. Por lo tanto, es necesario mejorar la biocompatibilidad de los stents de metal desnudo para obtener mejores resultados para los pacientes.
CD47 es una proteína transmembrana expresada omnipresentemente que inhibe la respuesta inmune innata cuando se une a su receptor cognado Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9. El receptor SIRP tiene un dominio de motivo inhibitorio de tirosina de células inmunitarias (ITIM) y los eventos de señalización en la interacción SIRP - CD47 resultan en última instancia en la regulación descendente de la activación celular inflamatoria10,11,12,13. La investigación en nuestro laboratorio ha demostrado que el CD47 recombinante o su derivado del péptido, correspondiente al dominio Ig de 22 aminoácidos de la región extracelular de CD47 (pepCD47), puede reducir la respuesta inmune del huésped a una gama de biomateriales clínicamente relevantes14,,15,,16. Recientemente, hemos demostrado que el pepCD47 puede ser inmovilizado a superficies de acero inoxidable y reducir significativamente la respuesta fisiopatológica asociada con la restenosis. Cabe destacar que las superficies modificadas pepCD47 son susceptibles a las condiciones de uso pertinentes, como el almacenamiento a largo plazo y la esterilización con óxido de etileno17. Con ese fin, pepCD47 puede ser una diana terapéutica útil para abordar las limitaciones clínicas de los stents endovasculares.
La estrategia para la fijación covalente de pepCD47 a una superficie metálica implica una serie de modificaciones químicas novedosas de la superficie metálica. Las superficies metálicas se recubren primero con bisfosfonato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) seguidos de la desprotección de los tioles y la unión de polietilenoimina (PEI) con grupos de piridilditioo instalados (PDT). Los grupos PDT de PEI no especificados en la reacción con tioles PABT desprotegidos reaccionan con pepCD47 incorporando tioles en los residuos terminales de cisteína, lo que resulta en la unión de pepCD47 a la superficie metálica a través de un enlace de disulfuro14,17,18. Utilizamos un fluoróforo conjugado pepCD47 (TAMRA-pepCD47) para determinar la concentración de entrada de péptido que resulta en la máxima inmovilización superficial del péptido. Finalmente, evaluamos la capacidad antiinflamatoria aguda y crónica de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47, ex vivo, utilizando el aparato de bucle Chandler, y el ensayo de expansión de apego/macrofago de monocitos, respectivamente.
Este documento proporciona un protocolo sistemático para la fijación de péptidos tiolados a la superficie metálica; determinar la densidad máxima de inmovilización del péptido; y evaluar las propiedades antiinflamatorias de las superficies metálicas recubiertas de pepCD47 expuestas a sangre entera y monocitos aislados.
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Protocol
Todas las muestras humanas para este experimento se obtuvieron de acuerdo con el IRB del Hospital de Niños de Filadelfia. Todos los experimentos con animales se realizaron previa aprobación de la IACUC del Hospital Infantil de Filadelfia.
1. Recubrimiento de superficies metálicas desnudas con PEI-PDT
- Lavar los cupones de papel de aluminio de acero inoxidable (1 cm x 1 cm o 0,65 cm x 1 cm) o discos de malla de acero inoxidable con 2-isopropanol en una coctelera (60 oC, velocidad de 200 rpm) durante 5 min. Realice este paso 2x. A continuación, lavar 2x con cloroformo (60 oC, velocidad de 200 rpm) durante 10 min cada uno.
- Colocar las muestras de acero inoxidable limpiadas en un horno a 220 oC durante 30 min.
- Preparar 5 ml de 0,5% de solución PABT disolviendo 25 mg de bifosfonato de poliallamina con grupos de tiol latentes (PABT) y 5 mg de bicarbonato de potasio (KHCO3) en 5 ml de DDW e incubar a 72 oC en una coctelera a 200 rpm durante 30 min.
NOTA: Para la síntesis PABT consulte la literatura publicada anteriormente18. - Sumergir las láminas horneadas o discos de malla en una solución acuosa al 0,5% de PABT e incubar en una coctelera (72oC, velocidad de 200 rpm) durante 1 h.
- Lave las muestras modificadas por PABT con agua destilada desionizada (DDW) durante 5x, transfiera las muestras en un vial nuevo y lave de nuevo con DDW durante 5x.
- Preparar un total de 5 ml de solución de TCEP (12 mg/ml) disolviendo 60 mg de clorhidrato de fosfina Tris (2-carboxyethyl) (TCEP) en 5 ml de tampón acético de 0,1 M (0,57 ml de ácido acético glacial, 820 mg de acetato de sodio en 100 ml de Tampón acético de DDW).
- Tratar las muestras modificadas por PABT con TCEP durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en una coctelera.
NOTA: TCEP se utiliza para desproteger los grupos tiol. - Degas DDW en un matraz de fondo redondo mediante el uso de un dispositivo de generación de vacío, como un liofilizador y lavar las láminas tratadas TCEP o discos de malla con DDW desgasificada para 5x. Transfiera las muestras en un vial nuevo y, además, lave 5 veces con DDW desgasificación.
NOTA: Es primordial trabajar rápido para evitar la oxidación de tioles en la superficie metálica por oxígeno atmosférico. - Preparar 5 ml de solución de PEI-PDT al 1% diluyendo 212,5 l de pei-PDT y 125 l de acetato de sodio de 0,4 M en DDW desgasalado. Lleve a cabo el paso 1.9 simultáneamente con el paso 1.8 para minimizar la exposición de las muestras al aire atmosférico.
NOTA: La síntesis de PEI-PDT se describe en la literatura publicada anteriormente18. - Incubar las muestras de acero inoxidable lavadas con 1% PEI-PDT. Reemplace el aire con gas de argón, selle los viales herméticamente y mezcle en una coctelera a RT durante 1 h. Proceda inmediatamente con la conjugación del péptido o guárdelo a 4 oC hasta 1 semana.
2. Acoplamiento y evaluación cualitativa/cuantitativa de la retención de pepCD47 conjugada con fluoróforo en superficie metálica utilizando microscopía de fluorescencia y fluorimetría
- Lave los cupones de papel de aluminio o los discos de malla preparados como se describe en la sección 1, pasos 1.1-1.10 anteriores con DDW 5x. Transfiera las muestras a un vial nuevo y lave con DDW durante 5x adicionales. Finalmente lavar 2x con etanol desgasedado y 2x con dimetil formamida desgasificación (DMF).
- Preparar la solución en stock conjugada con tetrametilrhodamina (TAMRA) pepCD47 disolviendo el polvo de pepCD47 conjugado con TAMRA en dimetilformamida desgasaltada (DMF) a una concentración final de 1 mg/ml. Aliquot la solución de stock en asignaciones de 1 ml. Conservar en tubos bien sellados bajo la atmósfera de argón a -20 oC.
- Diluir 1 mg/ml de la solución en stock de PEPCD47 conjugado con TAMRA utilizando DMF desgasificación para preparar las siguientes concentraciones de fluoróforo conjugado pepCD47 - 10, 30, 100 y 200 g/ml.
NOTA: Si el pepCD47 conjugado con TAMRA parece precipitarse, reduzca la solución pepCD47 conjugada con TAMRA en 20 min. Tenga en cuenta que antes de agregar el pepCD47 conjugado con TAMRA a las cuentas TCEP, gire la solución de cuentas TCEP, retire el sobrenadante y luego proceda con la adición del pepCD47 conjugado con TAMRA. - Incubar los cupones de lámina modificados PEI-PDT con 10, 30, 100 o 200 g/ml de pepCD47 conjugado con TAMRA en triplicados para cada condición en una coctelera en RT bajo atmósfera de argón durante 1 hora. Incubar discos de malla modificados PEI-PDT, así como disco de malla no modificado más allá del paso 1.2 (controles de metal desnudo) con 100 g/ml de pepCD47 conjugado con TAMRA en triplicados en RT bajo atmósfera de argón en una coctelera durante 1 h.
NOTA: A partir de este paso, los viales se envuelven en papel de aluminio para proteger el contenido de la luz. - Lavar las superficies conjugadas con fluoróforo con recubrimiento pepCD47 para eliminar el péptido no covalentemente unido en el siguiente orden: DMF (3x), DMF/DDW a 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS en 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min cada uno a 70 oC en una coctelera), DDW (3x), viales de cambio y un lavado DDW final.
- Coloque el control y los discos de malla conjugados covalentemente en un vidrio del microscopio, agregue 50 l de PBS y coloque un cubreobjetos. Discos de malla de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un conjunto de filtros de rodamina. Tome imágenes representativas con un aumento de 100x.
- Preparar 15 ml de solución TCEP de 12 mg/ml disolviendo 180 mg de TCEP en 1:1 v/v mezcla de metanol y 0,1 M tampón acético.
- Incubar cada lámina lavada con 1 ml de solución de TCEP en una coctelera a RT durante 15 min.
- Preparar las siguientes normas diluyendo en serie el caldo de pepCD47 conjugado con TAMRA (1 mg/ml) – 100 g/ml, 10 g/ml, 1 g/ml, 1 g/ml, 0,1 g/ml y 0,01 g/ml. Utilice la solución TCEP como diluyente.
- Analizar el pepCD47 conjugado con TAMRA liberado de la superficie metálica contra la curva de calibración generada utilizando las normas por fluorimetría a 544/590 nm de excitación y longitudes de onda de emisión.
3. Fijación de la pepCD47 humana a superficies modificadas PEI-PDT
- Lave las muestras recubiertas con PEI-PDT formuladas como se describe en la sección 1, pasos 1.1-1.10 anteriores, con DDW 5x desgasificación, cambie el vial y lave con DDW 5x desgasificación.
- Preparar la solución humana de pepCD47 (1 mg/ml) disolviendo el polvo humano pepCD47 en ácido acético desgastado al 50% para lograr una concentración de 1 mg/ml.
- Preparar la concentración de trabajo de pepCD47 humano (100 g/ml) disolviendo 500 l de la población de pepCD47 humano en 4.500 l de solución salina tamponada 1x fosfato desgasificación (PBS).
- Incubar las muestras lavadas con PEI-PDT con 100 g/ml de pepCD47 en RT con agitación durante 1 h.
- Lave las muestras recubiertas de pepCD47 para eliminar el exceso de péptido en el siguiente orden PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min cada uno), DDW (3x), cambiar los viales y el lavado final de DDW.
NOTA: Las superficies recubiertas de pepCD47 en humanos se pueden almacenar en seco a 4 oC durante un máximo de 6 meses.
4. Recubrimiento de las superficies modificadas PEI-PDT con secuencia revuelta (Scr)
- Disolver el polvo de secuencia revuelta en ácido acético desgasalado 0,1% para preparar una solución de stock de 1 mg/ml.
- Preparar una solución de 100 g/ml de péptido revuelto disolviendo 500 l de la en 4.500 l de ácido acético desgastado al 0,1%.
- Recubrir los especímenes de PEI-PDT lavados con 100 g/ml de péptido revuelto en RT con agitación durante 1 h.
- Para eliminar el péptido revuelto sin conectar, lave las superficies en el siguiente orden 0,01% ácido acético (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), cambio de viales y un lavado DDW.
5. Bucle Chandler para analizar la fijación celular a superficies metálicas
- Recubrir las láminas metálicas (0,65 cm x 1 cm) con pepCD47 humano o péptido revuelto según la descripción de la sección 1 seguida de 3 o 4.
- Corte tubos de PVC de 1/4" en tres trozos de 38 cm de largo.
- Inserte hasta 8 láminas metálicas modificadas de hasta 8 péptidos revueltos o pepCD47 en tres tubos diferentes.
- Recoger 30 ml de sangre de donantes humanos sanos libres de cualquier medicamento antiplaquetario según el protocolo institucional IRB. Precargue jeringa con 1 ml de citrato sódico al 4% para evitar la coagulación de la sangre recogida.
- Coloque 10 ml de sangre en cada tubo con una jeringa de 10 ml y conecte los extremos con adaptadores metálicos. Coloque los tubos llenos de sangre en las ruedas del aparato de bucle Chandler.
- Pasar la sangre a lo largo de las láminas metálicas por rotación de la rueda a 37 oC a la velocidad calculada para producir la cizalladura de 25 dyns/cm2 durante 4 h.
- Escurra la sangre de los tubos y deseche la sangre de acuerdo con los requisitos del IRB.
- Corte los tubos usando el bisturí para recuperar las láminas de cada tubo.
- Preparar una solución de glutaraldehído al 2% diluyendo los 10 ml de solución de glutaraldehído al 4% utilizando 10 ml de tampón de cacodilato sódico con cloruro de sodio de 0,1 M.
- Incubar las láminas en solución de glutaraldehído al 2% durante 15 min y conservar a 4oC durante la noche. Antes de analizar, lave las láminas metálicas 3x con PBS.
6. Análisis de la fijación celular a superficies metálicas utilizando tinte CFDA
- Caliente 8 ml de PBS en tubo de 15 ml en un baño de agua ajustado a 37 oC.
- Preparar la solución de colorante CFDA (diacetato de carboxy-fluorescein, éster de succinimidilo) de la siguiente manera - añadir 90 l de DMSO a un vial de tinte CFDA para lograr una concentración de stock de 10 mM. A continuación, preparar la concentración de trabajo de 93,75 m añadiendo 75 l de la acción CFDA a 8 ml de PBS caliente. Mezclar invirtiendo los tubos unas cuantas veces y cubrir el tubo con papel de aluminio.
NOTA: Es aconsejable preparar recién el tinte CFDA antes de cada uso. - Incubar cada lámina con 1 ml de tinte CFDA en una placa de 24 pozos. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar la placa a 37oC durante 15 min.
- Lave las láminas metálicas 3x con PBS para eliminar el exceso de colorante. Imagen con el microscopio de fluorescencia invertida.
7. Fijación de monocitos y expansión de macrófagos en las superficies metálicas de metal desnudo y modificados por pepCD47
- Recoger 10 ml de sangre periférica a través del acceso de la vena cava durante el sacrificio de una rata macho Sprague-Dawley de 400-450 g. Mezclar inmediatamente con 1.000 UI de heparina sódica para prevenir la coagulación.
- Pipeta 10 mL de gradiente de densidad medio en un tubo cónico de 50 ml. Mezclar la sangre con 5 ml de PBS, y caparazón cuidadosamente la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad utilizando una pipeta Pasteur. Centrifugar en un rotor de cucharón oscilante a 800 x g y 18-25 oC durante 20 minutos con ajustes mínimos de aceleración y desaceleración.
- Con una pipeta Pasteur, recoja una capa opaca de capa de buffy en la interfaz entre plasma y Ficoll. Diluir la capa buffy 1:3 con PBS y centrífuga a 550 x g y 4 oC durante 10 min a las células de la capa buffy.
- Re-suspenda las células de la capa buffy en 3 ml de tampón de lysis ACK para la lese contaminante eritrocitos. Incubar sobre hielo durante 4 min. Añadir 12 ml de búfer de separación de células (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Centrifugar a 550 x g y 4 oC durante 10 min. Vuelva a suspender el pellet en 10 ml de CSB.
- Centrifugar a 200 x g y 4 oC durante 10 min para eliminar las plaquetas. Repita dos veces.
- Vuelva a suspender el pellet en 500 ml de CSB. Agregue 10 g de cada uno de los siguientes anticuerpos anti-rata de ratón: CD8a (clon OX-8), anti-CD5 (clon OX-19), anti-CD45RA (clon OX-33) y anti-CD6 (clon OX-52).
- Incubar a 4oC en un rotador de tubo vertical durante 1 h. Añadir 9,5 ml de CSB. Centrifugar a 300 x g y 4 oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 ml de CSB y repita la centrifugación.
- Vuelva a suspender el pellet en 500 ml de CSB. Añadir 150 l de microperlas IgG anti-ratón de cabra. Incubar a 4oC en un rotador de tubo vertical durante 20 min. Añadir 9,5 ml de CSB. Centrifugar a 300 x g y 4 oC durante 10 min.
- Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de CSB.
- Coloque una columna LS en un separador magnético. Primer primer y medio la columna LS con 3 mL de CSB. Deseche el rendimiento de la columna. Añadir 1 ml de pellet celular re-suspendido del paso 7.10. Comience a recopilar el rendimiento. Después de que el flujo se detenga, agregue 5 mL de CSB y siga recopilando el rendimiento de la columna hasta que el flujo se detenga.
- Centrifugar el rendimiento de la columna (6 mL) que contiene monocitos seleccionados negativamente a 300 x g y 4 oC durante 10 min. Re-suspender el pellet pequeño resultante en 2 ml de RPMI-1640 medio complementado con 10% FCS, 1% pluma / estreptococo y 100 ng / ml de factor estimulante de colonia de macrófagos de rata (M-CSF).
- Cuente los monocitos usando hemocicómetro. Ajuste la concentración de monocitos a 5 x 105 células/ml.
- Añadir 1 ml de volúmenes de suspensión monocito a los pozos individuales de una placa de 12 pozos con las muestras de papel de aluminio inoxidable desnudas (N-3) o muestras de acero inoxidable modificadas con pepCD47 de rata (N-3) según 1.1-1.10 y 3.1-3.6.
- Cambie el medio en los días 3 y 5 después de la siembra. El día 6 después de la siembra lavar las células con PBS y fijar con 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 min. Lavar dos veces con PBS durante 5 min.
- Retire las láminas de acero inoxidable y colóquelas individualmente en una nueva placa de 12 pozos. No voltee las láminas.
- Incubar en 0.5% Tween-20/PBS durante 15 min para permeabilizar las células. Lavar dos veces con PBS durante 5 min.
- Bloquear en 10% suero de cabra/PBS durante 20 min. Aspirar el suero. No lavar. Añadir anticuerpos CD68 anti-ratas de ratón (diluido 1:100 en 1%BSA/PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar 3x en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Añadir cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 546 (diluido 1:200 en 1% BSA/PBS). Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min. Lavar en PBS durante 5 min. Contramancha con un tinte Hoechst 33342 de 1 g/ml en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min. Lavar 3x en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Voltee las láminas y la imagen usando un microscopio fluorescente con la óptica invertida. Captura imágenes con aumento de 200x con ajustes de filtro azul y rojo.
- Cuente los monocitos adjuntos en las imágenes individuales y calculó los promedios de grupo y las desviaciones estándar.
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Representative Results
Las superficies metálicas se vuelven tiol-reactivas para la fijación de péptidos a través de una serie de modificaciones químicas, como se ilustra en la Figura 1. La incubación PABT seguida del tratamiento PEI-PDT hace que la superficie metálica sea susceptible de fijación de péptidos. El péptido CD47 (pepCD47) que contiene residuos de cisteína en C-terminus unidos a la secuencia pepCD47 del núcleo a través de un puente AEEAc dual flexible se une covalentemente a las superficies tiol-reactivas a través de enlaces de disulfuro. Usando este protocolo, hemos demostrado que pepCD47 permanece establemente unido a la superficie metálica durante un máximo de seis meses y puede soportar el estrés fisiológico normal y los procedimientos de esterilización17.
La retención máxima de péptidos se determinó añadiendo pepCD47 conjugado por TAMRA a la superficie metálica seguida del lavado extensivo para eliminar el péptido no unido covalentemente, la escisión de TAMRA-pepCD47 mediante la reducción de puentes de disulfuro que atan el péptido a la superficie, y la cuantificación analítica mediante un ensayo fluorimétrico. Específicamente, el aumento de las cantidades de entrada de pepD47 conjugado con TAMRA (1 ml de solución de 10 - 200 g/ml) se añadió a las superficies recubiertas de PEI-PDT y se lavó varias veces para eliminar el péptido no unido covalentemente. La concentración de pepCD47 conjugado con TAMRA unido covalentemente se determinó utilizando un agente reductor TCEP para liberar el péptido unido covalentemente y evaluar su fluorescencia con respecto a las normas. La concentración de entrada de 10, 30, 100 y 200 g/ml demostró una retención de péptidos de 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 y 157 ± 25 ng/cm2 respectivamente (Figura 2). Por lo tanto, se encontró que la densidad máxima de inmovilización de pepCD472 en la superficie metálica era de aproximadamente 180 ng/cm2, lo que se logró con una concentración de entrada de 100 g/ml. La inmovilización adecuada de la pepCD47 conjugada con TAMRA en las superficies metálicas modificadas por PABT/PEI-PDT fue corroborada por microscopía de fluorescencia (Figura 3) que demostró una fluorescencia uniforme emitida desde la superficie de discos de malla tratados con TAMRA pepCD47 (Figura 3A). Sólo se detectó una fluorescencia mínima en la superficie de las mallas de control que carecía de modificación PABT/PEI-PDT(Figura 3B),excluyendo así un pepCD47 conjugado TAMRA no específicamente enlazado como fuente principal de fluorescencia.
A continuación, evaluamos la capacidad de las superficies recubiertas de pepCD47 para evitar la unión aguda de células transmitidas por la sangre en comparación con las superficies modificadas de péptido de secuencia no modificado y revuelto. El péptido revuelto tiene la misma composición de aminoácidos que pepCD47 pero en un orden diferente14,17. El apego a células transmitidas por la sangre fue evaluado por la rotación de sangre de voluntarios humanos sanos a través de superficies modificadas sin modificar, revueltas y pepCD47 en el aparato de bucle Chandler seguido de lavado para eliminar las células no unidas, fijación y tinción con tinte CFDA. Las superficies fueron visualizadas por microscopía de fluorescencia. De acuerdo con nuestros datos publicados anteriormente14,17 superficies recubiertas pepCD47 muestran una reducción drástica en la fijación de células transmitidas por la sangre en comparación con los controles modificados y no modificados revueltos ( Figura4).
Para ampliar los efectos de la modificación de la superficie de pepCD47 en la unión y proliferación de células inflamatorias, utilizamos la inmunoselección negativa de células de la capa de rata para aislar monocitos19,y cultivamos los monocitos aislados en láminas de acero inoxidable modificadas por pepCD47 y metal desnudo durante 6 días en presencia de M-CSF. Los resultados de este estudio muestran una atenuación combinada del 58% de la unión aguda de monocitos, su conversión fenotípica a macrófagos, y la proliferación de macrófagos en las superficies funcionalizadas pepCD47 (Figura 5A) en comparación con los controles de metal desnudo (Figura 5 B,C).
Figura 1: Representación esquemática de los pasos implicados en la adición de pepCD47 a superficies metálicas. (A) Las muestras de metal limpio se hornearon a 220 oC para oxidar la superficie metálica. Los grupos de bisfosfonato del bisfosfonato de la polidallamina con grupos de tiol latentes (PABT) formaron enlaces coordinados con los óxidos metálicos y recubren las superficies metálicas para formar una monocapa funcionalizada. Las superficies metálicas recubiertas PABT fueron tratadas con TCEP para la desprotección de los grupos tiol. (B) La estructura de PEI-PDT y la representación simbólica. (C) Las superficies recubiertas de PABT y las superficies reducidas TCEP fueron tratadas con PEI-PDT, lo que amplificó el número total de grupos reactivos de tiol disponibles para la fijación del péptido tiolado. Finalmente, las superficies recubiertas de PEI-PDT fueron reaccionadas con grupos terminales de cisteína de pepCD47, y el péptido se unió a la superficie a través de enlaces de disulfuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Determinación de la densidad de inmovilización de pepCD47 en superficie metálica. Se modificaron láminas metálicas de 1 cm x 1 cm utilizando concentraciones crecientes (10, 30, 100 y 200 g/ml) de pepCD47 conjugado con fluoróforo. El exceso de péptido se eliminó mediante varios pasos de lavado y luego se trató con 1 ml de solución TCEP para cortar el fluoróforo conjugado con fluoróforo. La concentración del péptido unido covalentemente a la superficie metálica se analizó fluorimétricamente utilizando una curva estándar preparada con concentraciones definidas de fluoróforo conjugado pepCD47. La densidad de inmovilización se representó como ng/cm2 de péptido unido a la superficie metálica. Los datos se expresan como ± SEM y son representativos de al menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de microscopía de fluorescencia de la superficie de acero inoxidable modificada con pepCD47 conjugado por TAMRA. Los discos de malla de acero inoxidable, modificados consecutivamente con PABT, TCEP, PEI-PDT (A) o sin modificar (B) fueron reaccionados con pepCD47 conjugado por TAMRA. Las mallas de metal desnudo correctamente conjugadas y de control fueron ampliamente lavadas y se fueron a la imagen a un aumento de 100x. La longitud de la barra de escala es de 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de las funciones antiinflamatorias y antitrombóticas agudas de pepCD47. Las láminas metálicas de 0,65 cm x 1 cm fueron recubiertas con 100 g/ml de pepCD47 humano o péptido revuelto y expuestas a la sangre en el aparato de bucle Chandler. Las células no enlazadas se eliminaron lavando con PBS y las láminas se fijaron en 2% de glutaraldehído. Las superficies modificadas por pepCD47 sin modificar, revueltas y sin modificar, se incubaron con el tinte CFDA durante 15 minutos a 37 oC, se lavaron con PBS y se analizaron con un microscopio de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Prevalencia de macrófagos CD68 positivos en las superficies metálicas desnudas y funcionalizadas por pepCD47. Los monocitos de origen sanguíneo periférico de rata fueron aislados por centrifugación de densidad de gradiente seguida de inmunoselección negativa con microperlas magnéticas. 5 x 105 monocitos se añadieron en los pozos de una placa de 12 pozos con muestras de papel de metal desnudo colocadas individualmente (N-3) o las muestras derivadas con pepCD47 de rata. La diferenciación de macrófagos fue estimulada por 100 ng/ml M-CSF. Seis días después de la siembra se fijaron las células, y se inmunorrestenieron con anticuerpos anti-rata CD68, anticuerpos conjugados subyecantes Alexa Fluor-546 (rojo) y contadores con tinte nuclear Hoechst 33342 (azul). Las imágenes representativas de las superficies de metal desnudo (A) y pepCD47-funcionalizadas (B) se capturaron con un aumento de 200x y se fusionaron. La longitud de la barra de escala es de 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Demostramos y describimos una estrategia química relativamente novedosa para anexar mitades de péptidos terapéuticos a una superficie de acero inoxidable con el objetivo general de reducir la reactividad de la superficie con las células inflamatorias que se encuentran en la sangre. La química del bisfosfonato descrita en el presente documento implica la formación coordinada de unión entre los óxidos metálicos y los grupos de bisfosfonato de PABT. El espesor de la monocapa de polibisfosfonato formado en la superficie metálica no supera los 5 nm18y, por lo tanto, es intrascendente para los posibles efectos proinflamatorios de los recubrimientos de polímero grueso20. La desprotección del grupo tiol latente en las cadenas laterales alifáticas de PABT prepara las superficies metálicas para una mayor modificación química con compuestos tiol-reactivos. PEI-PDT es polietilenimina ramificada (promedio de Mw-25.000) en la que el 20 % de los enlaces de etilenoimina se modifican con grupos de piridilditio reactivos. Dado que sólo una minoría de grupos de PDT en PEI-PDT se consumen en la reacción con los tioles derivados de PABT, la química superficial después de la tethering PEI-PDT se cambia a tiol-reactivo para permitir la fijación de péptidos tiolados18. Esta estrategia química fue desarrollada y ampliamente utilizada en nuestro laboratorio para la fijación de varias biomoléculas, tales como proteínas recombinantes14,péptidos14,,17,y vectores genéticos virales18 a la superficie metálica. Aunque, durante la mayor parte de nuestro trabajo hemos utilizado superficies de acero inoxidable, PABT puede interactuar con otras aleaciones metálicas21 y por lo tanto tiene el potencial de mejorar la biocompatibilidad y el potencial terapéutico de una amplia gama de biomateriales metálicos.
Nuestra metodología actual indica que la densidad máxima de inmovilización de fluoróforo conjugado pepCD47 en superficies metálicas es de 180 ng/cm2,que es menor en comparación con nuestros datos publicados anteriormente17. Atribuimos esta discrepancia a las diferentes estrategias de lavado utilizadas en ambos estudios. En nuestro protocolo actual hemos utilizado SDS que elimina completamente los péptidos no covalentemente unidos en comparación con Tween-20 que se utilizó en nuestros estudios iniciales. Sin embargo, 180 ng/cm2 corresponde a aproximadamente 4 x 106 moléculas/m2 de pepCD47. Esta densidad de inmovilización es mucho mayor que los niveles fisiológicos de CD47 en superficies celulares que son aproximadamente 390 moléculas/m2,22. Por lo tanto, predecimos que las condiciones de lavado estrictas no afectarían significativamente las propiedades antiinflamatorias de las superficies metálicas modificadas pepCD47.
Esta metodología de fijación de pepCD47 al metal es altamente reproducible, sin embargo hay varios pasos en el protocolo que necesitan una atención cuidadosa. En primer lugar, después de recubrir la superficie metálica con PABT y reducirla usando TCEP, los tioles son propensos a la oxidación cuando se exponen al aire. Por lo tanto, es de suma importancia que las superficies estén siempre sumergidas en agua desgasizada. Por la misma razón, la solución PEI-PDT se hace en agua desgasalada y el argón se añade a los viales durante la incubación de láminas recubiertas con PEI-PDT. En segundo lugar, hay que tener en cuenta el potencial de precipitación de péptidos solubilizados. PepCD47 tiene un residuo terminal de cisteína, así como residuos de cisteína en la secuencia. Por lo tanto, cuando se almacena incorrectamente, existe una alta posibilidad de que los péptidos polimericen y se precipitan fuera de la solución. Para abordar este problema potencial, se recomienda reducir los péptidos utilizando perlas TCEP durante 20 minutos a 1 h antes de la incubación con superficies recubiertas de PEI-PDT. TCEP ayudaría a reducir los péptidos y aumentar su solubilidad en su diluyente respectivo. También se recomienda desplazar el aire ambiente con argón en los viales mientras se incuban las muestras recubiertas de PEI-PDT con péptido tiolado.
Si se siguen las precauciones antes mencionadas, la técnica de recubrimiento es reproducible y la única limitación potencial para este enfoque es la no disponibilidad comercial de los reactivos PABT y PEI-PDT.
Utilizamos un aparato de bucle Chandler para proporcionar prueba de análisis conceptual ex vivo para entender la interacción de las superficies metálicas modificadas pepCD47 con las células sanguíneas y ha sido utilizado con éxito por nuestro laboratorio para mostrar las propiedades antiinflamatorias de las superficies recubiertas de pepCD4714,,15,,17,,23. En este estudio, utilizamos el tinte CFDA que fluoresces sólo después de entrar en las células cuando los grupos de acetato del tinte son cortados por la esterasa intracelular. Los beneficios de este procedimiento de tinción son que mancha las plaquetas anucleadas y los glóbulos rojos, así como las células nucleadas como los leucocitos. Por lo tanto, la utilización de tinte CFDA proporciona una evaluación de las propiedades antitrombóticas agudas y antiadhesivas de las superficies recubiertas de pepCD47. Una evaluación más detallada se puede adquirir mediante microscopía electrónica de barrido y/o inmunomanchas, que detallamos anteriormente24. Los resultados del estudio actual validan que las superficies metálicas recubiertas de pepCD47 humanas son antitrombóticas y antiadhesivas en comparación con los controles de secuencia no modificados y revueltos.
Investigar más a fondo si las superficies modificadas por pepCD47 alteran las características de crecimiento de las células inflamatorias unidas, las láminas de acero inoxidable de metal desnudo o las láminas formuladas con pepCD47 se expusieron a monocitos aislados de ratas en presencia de M-CSF singénez. Las células se cultivaron en condiciones estacionarias durante 6 días para permitir la conversión fenotípica y la expansión de los macrófagos. De acuerdo con nuestros resultados anteriores observados en los diferentes escenarios experimentales14, se demostró una profunda disminución del número de células inflamatorias en las superficies funcionalizadas pepCD47 en el estudio actual.
Por lo tanto, nuestros estudios demuestran en última instancia que la nueva química de polibisfosfonato para el recubrimiento de metales con pepCD47 es una forma eficaz de mejorar la biocompatibilidad de las superficies metálicas y se puede aplicar en otras aplicaciones biomédicas, como las articulaciones artificiales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El desarrollo de protocolos y los estudios presentados en este documento fueron apoyados por la financiación de NIH (NBIB) R01 (EB023921) a IF y SJS, y la financiación NIH (NHLBI) R01 (HL137762) a IF y RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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