CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması
Summary
Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.
Abstract
Çıplak metal stentler ve ilaç eluting stentleri ile ilişkili önemli komplikasyonlar sırasıyla in-stent restenozisi ve geç stent trombozudur. Bu nedenle, metal stentlerin biyouyumluluğunun iyileştirilmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu protokolün amacı, endovasküler stentler de dahil olmak üzere, kanla temas eden tıbbi implantların biyouyumluluğunu artırmak için biyolojik olarak aktif peptidler tarafından metal yüzey modifikasyonu için sağlam bir teknik tanımlamaktır. CD47 kendini bir immünolojik tür-özgü belirteç ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Çalışmalar, ekstrasellüler bölgede CD47’nin Ig etki alanına karşılık gelen 22 amino asit peptidin (pepCD47), tam uzunlukta protein gibi anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Farelerde in vivo çalışmalar, ve bizim laboratuvardan tavşan ve insan kanı deneysel sistemlerde ex vivo çalışmalar metaller üzerinde pepCD47 immobilizasyon inflamatuar hücre eki ve aktivasyon önleyerek biyouyumluluğu artırdığını göstermiştir. Bu makalede, metal yüzeylerin ve peptit eki işlevselleştirilmesi için adım adım protokol açıklanmaktadır. Metal yüzeyler, gizli tiyol grupları (PABT) ile poliallilin bifosfat kullanılarak modifiye edilir ve ardından tiyollerin korunması ve piriyldithio grupları (PEI-PDT) ile yüklü polietileninile reaksiyon yoluyla tiyol-reaktif bölgelerin güçlendirilmesi sağlanır. Son olarak, pepCD47, bir çift 8-amino-3,6-dioksan-oktavoil spacer ile çekirdek peptid dizisine bağlı terminal sistein artıkları içeren, disülfür bağları ile metal yüzeye bağlı. Metal yüzeye peptit eki Bu metodoloji verimli ve nispeten ucuz ve böylece çeşitli metalik biyomalzemelerin biyouyumluluğu artırmak için uygulanabilir.
Introduction
Perkütan koroner girişim koroner arter hastalıkları (CAD) tedavisinde tedavinin ilk satırı ve öncelikle hastalıklı arterler stentleme içerir. Ancak stent restenozisi (ISR) ve stent trombozu stent konuşlandırma ile ilişkili sık karşılaşılan komplikasyonlardır1. Kan stent arayüzünde kan etkileşimi metal yüzeyinde plazma proteinlerinin neredeyse hemen adsorpsiyon ile karakterizedir, trombosit ve inflamatuar hücre eki ve aktivasyon takip2. Aktive inflamatuar hücrelerden inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin salınımı, tunica media’daki vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC) fenotibik modifikasyonuna yol açar ve merkezsel intimal bölmeye merkezsel göçlerini tetikler. İntimada aktive vsmc’nin çoğalması intimal tabaka kalınlaşması, lümen daralması3ve stent içi restenoz 3 ile sonuçlanır. VSMC proliferasyonlarını önlemek için uyuşturucu eluting stentleri (DES) geliştirilmiştir; ancak, bu ilaçların endotel hücreleri üzerinde hedef dışı sitotoksik etkisi var4,5. Bu nedenle, geç stent trombozu DESileilişkili sık görülen bir komplikasyondur6 ,7. Poli-L-laktit gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimerlerden yapılmış stentler hayvan deneylerinde ve ilk klinik çalışmalarda çok umut vaat etmiş, ancak “gerçek hayattaki” klinik8kullanım3. Bu nedenle, daha iyi hasta sonuçları için çıplak metal stentbiyouyumluluğunu artırmak için bir ihtiyaç vardır.
CD47, konjenital reseptörSignal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9’abağlandığında doğuştan gelen bağışıklık yanıtını inhibe eden her yerde ifade edilen transmembran proteinidir. SIRPα reseptörü bir bağışıklık hücresi tirozin inhibitör motifi vardır (ITIM) etki alanı ve SIRPα üzerine sinyal olaylar – CD47 etkileşimsonuçta inflamatuar hücre aktivasyonu10downregulation neden10 ,11,12,13. Laboratuarımızda araştırma rekombinant CD47 veya peptit türevi, CD47 (pepCD47) ekstrasellüler bölgenin 22 amino asit Ig etki alanına karşılık, klinik olarak ilgili biyomalzemeler14bir dizi ev sahibi bağışıklık yanıtı azaltabilir göstermiştir 14,15,16. Son zamanlarda, pepCD47 paslanmaz çelik stent yüzeylere hareketsiz olabilir ve önemli ölçüde restenosis ile ilişkili patofizyolojik yanıtı azaltmak göstermiştir. Not, pepCD47 modifiye yüzeyler uzun süreli depolama ve etilen oksit sterilizasyonu17gibi ilgili kullanım koşullarına uygundur. Bu amaçla, pepCD47 endovasküler stentlerin klinik sınırlamaları gidermek için yararlı bir terapötik hedef olabilir.
PepCD47’nin metal bir yüzeye kovalent bağlanması için strateji, metal yüzeyin inyeni kimyasal modifikasyonları içerir. Metal yüzeyler ilk olarak poliallilin bifosfonat ile gizli tiyol grupları (PABT) ile kaplanır ve ardından tiyollerin korunması ve polietilenin (PEI) yüklü piriyldithio grupları (PDT) ile bağlanması nı sağlar. PEI PDT grupları deprotected PABT tiols ile reaksiyonda tüketilmemiş sonra pepCD47 terminal sistein artıkları thiols içeren ile tepki, bir disülfür bağı ile metal yüzeyine bağlayıcı pepCD47 sonuçlanan14,17,18. Biz peptid maksimum yüzey immobilizasyonu ile sonuçlanan peptit giriş konsantrasyonu belirlemek için bir florofor konjuge pepCD47 (TAMRA-pepCD47) kullanılır. Son olarak, pepCD47 kaplı metal yüzeylerin akut ve kronik anti-inflamatuar kapasitesi, chandler döngü aparatı kullanılarak ex vivo ve monosit eki/makrofaj genleşme tayini sırasıyla değerlendirildi.
Bu kağıt, metal yüzeye tiolated peptidlerin bağlanması için sistematik bir protokol sağlar; peptidin maksimum hareketsizlik yoğunluğunun belirlenmesi; ve tam kan ve izole monositlere maruz kalan pepCD47 kaplamalı metal yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini değerlendirmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz göstermek ve kanda bulunan inflamatuar hücreler ile yüzeyin reaktivitesini azaltmak için kapsamlı amacı ile paslanmaz çelik bir yüzeye terapötik peptid moieties eklemek için nispeten yeni bir kimyasal strateji açıklar. Burada açıklanan bifosfonat kimyası, metal oksitler ve PABT’nin bifosfonat grupları arasındaki koordinat bağı oluşumunu içerir. Metal yüzeyde oluşan polibisfosfonat monolayer kalınlığı 5 nm18aşmaz, ve bu nedenle, kalın polimer kaplamaların potansiye…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makalede sunulan protokol geliştirme ve çalışmalar NIH (NBIB) R01 finansmanı (# EB023921) tarafından IF ve SJS’e, NIH (NHLBI) R01 finansmanı (# HL137762) ile IF ve RJL’ye desteklenmiştir.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of ‘marker of self’ CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
