Planarian Scrunching как количественный поведенческий считывание для вредных стимулов зондирования
Summary
Пресноводные планарианцы демонстрируют три походки (скольжение, перистализ и сморщение), которые различимы количественным поведенческим анализом. Мы описываем метод, чтобы вызвать scrunching с помощью различных вредных стимулов, количественной оценки из них, и различие от перистализа и скольжения. Используя генный нокдаун, мы демонстрируем специфику хруста в качестве количественного фенотипического считывания.
Abstract
Пресноводные планарианцы обычно плавно скользят через цилиарную двигательную установку на их брюшной стороне. Некоторые экологические условия, однако, может вызвать мускулатуры инициативе формы передвижения: перистализ или scrunching. В то время как перистализ является результатом цилиарного дефекта, scrunching не зависит от функции ресничок и является специфическим ответом на определенные стимулы, включая ампутацию, вредные температуры, экстремальный рН и этанол. Таким образом, эти две мускулатурно-управляемые походки механистически отличаются. Тем не менее, они могут быть трудно отличить качественно. Здесь мы предоставляем протокол для индуцирования scrunching с использованием различных физических и химических стимулов. Мы подробно количественные характеристики scrunching, которые могут быть использованы, чтобы отличить его от перистализа и скольжения, используя свободно доступное программное обеспечение. Поскольку сморщение является универсальной планарной походкой, хотя и с характерными характерными видами специфических различий, этот протокол может быть широко применен ко всем видам планариев, при использовании соответствующих соображений. Чтобы продемонстрировать это, мы сравниваем реакцию двух самых популярных планарных видов, используемых в поведенческих исследованиях, Dugesia japonica и Schmidtea mediterranea, с тем же набором физических и химических стимулов. Кроме того, специфика scrunching позволяет этот протокол, который будет использоваться в сочетании с РНК-интерференции и / или фармакологического воздействия вскрыть молекулярных целей и нейронных цепей участие, потенциально обеспечивая механистическое понимание важных аспектов ноцицепции и нервно-мышечной связи.
Introduction
В дополнение к своей популярности для исследованиястволовых клеток и регенерации 1,2,3, пресноводных planarians уже давноиспользуются в поведенческих исследованиях 4,5, воспользовавшись их сравнительно большой размер (несколько миллиметров в длину), легкость и низкая стоимость лабораторного обслуживания, а также широкий спектр наблюдаемых поведения. Внедрение компьютерного зрения и автоматизированного отслеживания планарныхисследований поведения 6,,7,,8,,9,,10,,11 позволило количественной дифференциации поведенческих фенотипов. Поведение животных является прямым считыванием нейронной функции. Потому что планарианская нервная система среднего размера и сложности, но разделяет сохраненные ключевые элементыс позвоночным мозгом 12,13,14, изучение планарного поведения может дать представление о сохраненных механизмов нейронального действия, которые могут быть трудно непосредственно зонд в более сложных организмов. Таким образом, планарианцы являются ценной моделью для сравнительных нейробиологическихисследований 8,,12,,15,,16,,17,,18,,19,,20,,21. Кроме того, водная среда позволяет быстрое и легкое воздействие химических веществ для изучения их влияния на функции мозга в регенерации и взрослых planarians, что делает их популярной системой нейротоксикологии22,23,24,25,26.
Планарианцы обладают тремя различными походки, называют скольжения, перистрализа, и scrunching. Каждая походка выставлена при определенных обстоятельствах: скольжение походка по умолчанию, перистализ возникает, когда цилиарная функцияскомпрометирована 7,27, и scrunching является побег походка – независимо от функции ресничок – в ответ на определенные вредныестимулы 7. Мы показали, что scrunching является специфическим ответом, вызвано ощущением определенных химических или физических сигналов, в том числе экстремальных температур или рН, механические повреждения, или конкретные химические индукторы, и, таким образом, не является общейреакции стресса 7,28,29.
Из-за своей специфичности и стереотипных параметров, которые можно легко количественно с помощью этого протокола, scrunching является мощным поведенческим фенотипом, который позволяет исследователям выполнять механистические исследования, рассекая сенсорные пути и нейрональный контроль поведения25,28. Кроме того, scrunching было показано, что чувствительные конечной точкой для анализа неблагоприятного химического воздействия на развитие нервной системы и функциив нейротоксикологии исследований 22,24,25,30. Как несколько различных сенсорных путей, кажется, сходятся, чтобы вызвать scrunchingчерез различные механизмы 28, scrunching отличается от других планарных поведения, потому что различные, но конкретные, стимулы могут быть использованы для вскрытия различных нейронных цепей и изучить, как различные сигналы интегрированы для производства scrunching фенотипа.
Важно отметить, что существуют различия видов, в которых одно химическое вещество может вызвать сморщение в одном планерианских видах, но другая поведенческая реакция в другом. Например, мы обнаружили, что анандамид вызывает scrunching в планарных видов Dugesia japonica, но вызывает перистализ в Schmidtea mediterranea28. Этот пример подчеркивает важность того, чтобы быть в состоянии надежно различать различные походки, потому что они являются фенотипическими проявлениями различных молекулярных механизмов. Тем не менее, различие scrunching от перистализа трудно использовать качественные данные наблюдения, потому что обе походки мускулатуры инициативе идоля качественного сходства 7,28. Таким образом, для различения походок необходимо выполнить визуализацию ресничок или количественное поведенческое исследование, которое позволяет проводить различие на основехарактерных параметров 7,,28. Потому что реснички изображений является экспериментально сложной задачей и требует специализированного оборудования, таких как высокое увеличение соединениямикроскопа и высокоскоростной камеры 7,28, это не так широко доступны для исследователей, как количественный поведенческий анализ.
Здесь мы представляем протокол для (1) индукции scrunching с использованием различных физических (вредные температуры, ампутации, почти УФ-излучения) и химических (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyde) стимулы и (2) количественный анализ планарного поведения с использованием свободно доступных программ. Путем количественной оценки четырех параметров (частота колебаний длины тела, относительная скорость, максимальная амплитуда, и асимметрия удлинения тела и сокращения)7, scrunching может быть дифференцирована от скольжения, перистализа и других поведенческих состояний, о которых сообщается в литературе, таких как змеи, как движение15 или эпилепсии 15. Кроме того, в то время как scrunching сохраняется среди различных планарныхвидов 7, каждый вид имеет свою собственную характерную частоту и скорость; поэтому, как только скорость скольжения и сморщения вида были определены, скорость сама по себе может быть использована в качестве средства, чтобы отличить scrunching от скольжения иперистализа 29. Протокол не предполагает предварительного обучения в вычислительном анализе изображений или поведенческих исследованиях и, таким образом, также может быть применен для планарных поведенческих экспериментов в контексте учебной лаборатории на уровне бакалавриата. Примерные данные для облегчения адаптации протокола приведены в дополнительном материале.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя этот протокол, можно количественно изучить влияние физическихи химических стимулов 7,,28,,29 или генетических манипуляций(РНК) 28,29 на планарных передвижения. Чтобы максимизировать пространствен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят г-на Тапана Гоэля за комментарии к рукописи. Эта работа была профинансирована NSF CAREER Грант 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
