Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching
Summary
Tatlı su planarians üç yürüyüş sergiler (kayma, peristalsis, ve scrunching) kantitatif davranış analizi ile ayırt edilebilir. Çeşitli zararlı uyaranlar, bunların nicelliği ve peristalsis ve süzülme ayrımı kullanılarak scrunching’i tetikleyen bir yöntem tanımladık. Gen nakavtını kullanarak, kantitatif henotipik okuma olarak scrunching özgüllüğünü gösteririz.
Abstract
Tatlı su planarians normalde kendi ventral tarafında siliyer itiş yoluyla sorunsuz kayma. Ancak bazı çevre koşulları kas lara bağlı hareket biçimlerine neden olabilir: peristalsis veya scrunching. Peristalsis bir siliyer defektinden kaynaklanırken, scrunching silia fonksiyonundan bağımsızdır ve ampütasyon, zararlı sıcaklık, aşırı pH ve etanol gibi belirli uyaranlara özgü bir tepkidir. Böylece, bu iki kas odaklı yürüyüş mekanistik farklıdır. Ancak, nitel olarak ayırt etmek zor olabilir. Burada, çeşitli fiziksel ve kimyasal uyaranlar kullanılarak scrunching indükleme için bir protokol sağlar. Serbestçe kullanılabilen bir yazılım kullanarak peristalsis ve kaymadan ayırt etmek için kullanılabilen scrunching’in nicel karakterizasyonunu ayrıntılarıyla anlatıyoruz. Scrunching evrensel bir planarian yürüyüş olduğundan, karakteristik türlere özgü farklılıklar olsa da, bu protokol genel olarak planarians tüm türler için uygulanabilir, uygun hususlar kullanılarak. Bunu göstermek için, davranışsal araştırmalarda kullanılan en popüler iki planertürün yanıtını karşılaştırıyoruz, Dugesia japonica ve Schmidtea mediterranea, aynı fiziksel ve kimyasal uyaranlarla. Ayrıca, scrunching özgüllüğü bu protokolün RNA girişim ve / veya ilgili moleküler hedefler ve nöronal devreleri incelemek için farmakolojik maruz kalma ile birlikte kullanılmasına olanak sağlar, potansiyel nosiception ve nöromüsküler iletişim önemli yönleri ne mekanik anlayış sağlayan.
Introduction
Kök hücre ve rejenerasyon araştırma1,2,,3, tatlı su planarians için popülerlik ek olarak uzun davranış çalışmaları kullanılmıştır4,5, onların nispeten büyük boyutu yararlanarak (uzunluğu birkaç milimetre), kolay ve laboratuvar bakım düşük maliyet, ve gözlemlenebilir davranışların geniş spektrumlu. Bilgisayarlı görme ve planer davranış çalışmaları6,7,8,,9,10,11 için otomatik izleme giriş davranış lı fenotiplerin nicel farklılaşmasını sağlamıştır. Hayvan davranışları nöronal fonksiyonun doğrudan okunmasıdır. Planer sinir sistemi orta boy ve karmaşıklık ta olduğu için, ancak omurgalı beyin12,13,,14ile korunmuş anahtar elementleri paylaştığı için, planer davranışların incelenmesi, daha karmaşık organizmalarda doğrudan araştırmak zor olabilecek nöronal eylemin korunmuş mekanizmalarına ışık verebilir. Böylece, planarians karşılaştırmalı nörobiyoloji çalışmaları için değerli bir model8,12,15,16,17,18,19,20,21. Buna ek olarak, su ortamında kimyasallara hızlı ve kolay maruz kalma için rejenerasyon ve yetişkin planarians beyin fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir, onları nörotoksikoloji için popüler bir sistem yapma22,23,24,25,26.
Planarianlar kayma, peristalsis ve scrunching olarak adlandırılan üç farklı yürüyüş, sahip. Her yürüyüş belirli koşullar altında sergilenir: kayma varsayılan yürüyüş, peristalsis siliary fonksiyonu tehlikeye oluşur7,27, ve scrunching bir kaçış yürüyüşü – cilia fonksiyonu bağımsız – bazı zararlı uyaranlara yanıt olarak7. Biz scrunching belirli bir yanıt olduğunu göstermiştir, bazı kimyasal veya fiziksel ipuçları hissi tarafından ortaya, aşırı sıcaklıklar veya pH dahil, mekanik yaralanma, ya da belirli kimyasal indükleyiciler, ve böylece genel bir stres tepkisi7değildir,28,29.
Özgüllüğü ve basmakalıp parametreleri nedeniyle, kolayca bu protokol kullanılarak ölçülebilir, scrunching araştırmacılar duyusal yollar ve davranış nöronal kontrol diseksiyon mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için olanak sağlayan güçlü bir davranışsal fenotip25,28. Ayrıca, scrunching sinir sistemi gelişimi ve nörotoksikoloji çalışmalarında fonksiyon üzerinde olumsuz kimyasal etkileri tsay hassas bir bitiş noktası olduğu gösterilmiştir22,24,25,30. Birkaç farklı duyusal yollar çeşitli mekanizmalar28ile scrunching ikna etmek için yakınsama gibi görünüyor gibi, çeşitli çünkü scrunching diğer planer davranışlardan farklıdır, ama özel, uyaranlar farklı nöronal devreleri incelemek ve farklı sinyaller inscrunching fenotip üretmek için entegre nasıl çalışma için kullanılabilir.
Daha da önemlisi, tür farklılıkları vardır, oysa bir kimyasal bir planarian türde scrunching ortaya çıkabilir, ama başka bir farklı bir davranışsal tepki. Örneğin, biz anandamid planarian türler Dugesia japonica scrunching neden olduğunu bulduk ama Schmidtea mediterranea28peristalsis neden olur . Bu örnek, farklı moleküler mekanizmaların henotibik tezahürleri olduğundan, farklı yürüyüş leri güvenilir bir şekilde ayırt edebilmenin önemini vurgulamaktadır. Ancak, peristalsis scrunching ayrım nitel gözlemsel veri kullanarak zordur, her iki gait kas odaklı ve paylaşmak nitel benzerlikler7,,28çünkü . Bu nedenle, yürüyüş ayırt etmek için bu cilia görüntüleme veya karakteristik parametreler7 dayalı ayrım sağlayan bir nicel davranışsal çalışma yapmak için gereklidir7,28. Çünkü cilia görüntüleme deneysel zorlu ve yüksek büyütme bileşik mikroskop ve yüksek hızlıkamera7 gibi özel ekipman gerektirir 7,28, bu nicel davranış analizi gibi araştırmacılar için geniş erişilebilir değildir.
Burada, (1) çeşitli fiziksel (zararlı sıcaklık, ampütasyon, yakın UV ışığı) ve kimyasal (allyl izothiocyanat (AITC), cinnamaldehit) uyaranları ve (2) serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak planarian davranışın kantitatif analizi kullanılarak scrunching indüksiyon uğrama için bir protokol satıyoruz. Dört parametre (vücut uzunluğu salınımları sıklığı, göreli hız, maksimum genlik ve vücut uzama ve daralma asimetrisi) ölçerek7, scrunching kayma ayırt edilebilir, peristalsis, ve diğer davranışdurumları literatürde bildirilen, yılan gibi hareket15 veya epilepsi esme15gibi . Ayrıca, scrunching farklı planarian türler arasında korunur iken7, Her türün kendi karakteristik frekans ve hız vardır; bu nedenle, bir türün kayma ve scrunching hızları belirlendikten sonra, hız tek başına kayma ve peristalsis29scrunching ayırt etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Protokol, hesaplamalı görüntü analizi veya davranış salg›r›mlar›nda önceden bir eðitim bulunmad›r ve bu nedenle lisans düzeyinde bir öğretim laboratuvar›nda planer davranış deneyleri için de uygulanabilir. Protokol adaptasyonuna yardımcı olmak için örnek veriler Ek Malzeme’de verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolü kullanarak, bir nicel fiziksel ve kimyasal uyaranların etkilerini inceleyebilirsiniz7,28,29 veya genetik manipülasyon (RNAi)28,29 planarian hareket üzerinde. Mekansal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için kamerayı arenaya mümkün olduğunca yakın hareket ettirirken tüm arenanın görüş alanında olmasını sağlamak en iyisidir. İş …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, tapan Goel’e el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ediyor. Bu çalışma NSF CAREER Grant 1555109 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
