المراقبة المجهرية لديناميات الخلايا الليمفاوية في بقع الجرذ بير
Summary
هنا ، نحن وصف طريقة دقيقة لجمع الخلايا الليمفاوية القناة الصدرية ومراقبة هجرة الأمعاء الاستوائية الليمفاوية في بقع الفئران بير لمدة 3 ساعات باستخدام التصوير الفوتوغرافي الفاصل الزمني. يمكن لهذه التقنية توضيح كيفية تأثر ديناميكيات الخلايا اللمفاوية في ظل الظروف الالتهابية.
Abstract
الخلايا الليمفاوية الساذجة إعادة تدوير من الدم إلى الأنسجة اللمفاوية في ظل حالة فسيولوجية ومن المسلم به عادة كظاهرة هامة في مناعة الأمعاء. إن الستروما للأعضاء اللمفاوية الثانوية، مثل بقع بير (PPs) أو الغدد الليمفاوية المتوسطة، هي المكان الذي تشعر فيه الخلايا الليمفاوية الساذجة بمضادات. تنتشر الخلايا الليمفاوية الساذجة عبر مجرى الدم للوصول إلى الغدد الصماء العالية ، وهي بوابة الدخول إلى PPs. وتشير التقديرات إلى أن بعض العوامل المناعية تؤثر على هجرة الخلايا اللمفاوية، ولكن التقييم الدقيق لديناميات دوران الأوعية الدقيقة صعب للغاية، ويمكن أن يساهم إنشاء طريقة لمراقبة هجرة الخلايا اللمفاوية في الجسم الحي في توضيح الآليات الدقيقة. قمنا بتحسين طريقة جمع الخلايا الليمفاوية من القناة الليمفاوية ومراقبة الديناميكيات التفصيلية لللمفيات الأمعاء المدارية في أجهزة فئران الغدد الليمفاوية. اخترنا التصوير المجهري بالليزر confocal لمراقبة الفئران PPs في الجسم الحي وسجلها باستخدام التصوير الفوتوغرافي الفاصل الزمني. يمكننا الآن الحصول على صور واضحة يمكن أن تسهم في تحليل ديناميات الخلايا اللمفاوية.
Introduction
بقع بير (PPs) تتكون من مئات من بصيلات اللمفية في بروبريا لامينا من الأمعاء الدقيقة. وتنقسم PPs إلى بصيلات، والمنطقة بين الخلايا، ومراكز الجرثومية الموجودة في الجزء السفلي من المسام، حيث يتم تحفيز الخلايا الليمفاوية عن طريق عرض المستضد. لا توجد أوعية اللمفاوية afferent، والمستضدات غزو بروبريا لامينا من تجويف الأمعاء عبر طبقة الخلايا الظهارية. وتسمى المنطقة الظهارية التي تغطي بصيلات اللمفية الظهارة المرتبطة بصيلات، والتي في إطارها تخصص تتخللها الخلايا M امتصاص مستضدات المخاطي. الخلايا M تأخذ في المستضدات من الجانب الإنارة ويتم القبض على المستضدات ثم بواسطة الخلايا التشعبية وتقديم نحو الخلايا الليمفاوية الساذجة التي تتدفق إلى PPs من خلال endothelium من venuhelial عالية (HEVs)1. Pps تلعب دورا هاما في مناعة الأمعاء وترتبط مع مرحلة مبكرة من الالتهاب. العديد من التفاعلات الجزيئية تنطوي على دخول الخلايا الليمفاوية إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (SLOs), بما في ذلك جزيئات التصاق, chemokines2,3, وsphingosine-1-فوسفات4; وهكذا، هناك العديد من الأهداف العلاجية المتوقعة. لذلك ، فإن مراقبة ديناميكيات الخلايا اللمفاوية داخل PPs تمكننا من إلقاء نظرة على المرحلة المبكرة من الالتهاب وفحص فائدة العديد من الأدوية الواعدة.
تركز الطريقة هنا على هجرة الخلايا الليمفاوية في PPs ، والتي تشمل العديد من الإجراءات (التشبية في القناة الصدرية5 وجمع الخلايا الليمفاوية والمراقبة على المدى الطويل بعد الحقن في الخلايا الليمفاوية التي تم جمعها). وبما أن هذه الإجراءات معقدة وكان من الصعب أن نرى بالضبط كيف تم تنفيذ كل إجراء في التقارير السابقة، فقد ذكرنا هنا بعض النصائح لتحقيق ملاحظة ناجحة. على سبيل المثال، كان تحبيب الأنابيب في القناة الصدرية صعباً للغاية، وكان معدل النجاح الأولي للزباة أقل من 50٪. ومع ذلك، قمنا بتحسين الأسلوب وحققنا نسبة نجاح تتجاوز 80٪. ذكرنا بعض النصائح الأخرى في هذه المخطوطة التي تعتبر ضرورية لمراقبة ناجحة لتمكين التقييم الكمي للهجرة عبر الغدد الليمفاوية في ظل عدة شروط.
في التقارير السابقة ، كان من الصعب فهم التغيرات ثلاثية الأبعاد مع مرور الوقت ، مثل الحقن الوريدي للحبر الهندي لطخة بنية الأوعية الدموية من PPs6، أو المجهر يجري أحادية البؤر7. في السنوات الأخيرة، طريقة الرصد باستخدام بعض الحيوانات المعدلة وراثيا بروتين الفلورانس الفلورية الضوئية مثل الفئران Kaede قد أوضحت الحركات الخلوية المنهجية في الجسم الحي8. وأوضحت الدراسة الأخرى CD69 اغلاق مستقل من خروج الخلايا الليمفاوية من PPs9. استخدمنا التصوير المجهري بالليزر confocal (CLSM) بسبب قدرته التحليلية العالية. الآن يمكننا الحصول بسهولة على صور عالية الدقة واستخدامها لتحليل ديناميكيات الخلايا اللمفاوية.
في هذا التقرير، أظهرنا سلسلة من الطرق لتقييم هجرة الخلايا اللمفاوية في PPs. أولاً، أظهرنا طرقاً محسنة لتكبوس القناة الصدرية لجمع الخلايا الليمفاوية. ثانيا، قمنا بتحسين أساليب الرصد بعدة طرق للحفاظ على الأعضاء الموضوعية كلما أمكن تحت المراقبة المجهرية، مما يمكننا من الحصول على صور عالية الجودة لمدة 3 ساعات. ثالثاً، قمنا بتحديد حجم الحركات الخلوية لهجرة الخلايا اللمفاوية لتقييم آثار بعض الأدوية. وستسهم هذه البروتوكولات المعدلة في تطوير تقييمات المناعة المخاطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا بروتوكول لجمع الغدد الليمفاوية الأمعاء الاستوائية الساذجة ومراقبة هجرتهم في الفئران PPs. هذه الإجراءات يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا الليمفاوية في microvasculature من PPs وجعل من الممكن مقارنة بصريا دينامياتها في ظل حالة طبيعية أو العلاج. الملاحظة المباشرة لهذه الديناميات لها ميزة ك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من خلال منح من كلية الطب الدفاع الوطني ومنحة البحوث الصحية والعمالية للبحوث المتعلقة بالأمراض المستعصية من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية، اليابان.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
