Microscopische observatie van lymfocytendynamiek in rat Peyer's patches
Summary
Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het verzamelen van thoracale kanaallymfocyten en het observeren van de migratie van darm-tropenlymfocyten in de patches van rat Peyer gedurende 3 uur met behulp van time-lapse fotografie. Deze techniek kan verduidelijken hoe de dynamiek van lymfocyten wordt beïnvloed onder inflammatoire omstandigheden.
Abstract
Naïeve lymfocyten recirculeren van het bloed naar de lymfoïde weefsels onder fysiologische toestand en het wordt algemeen erkend als een belangrijk fenomeen in de darmimmuniteit. Het stroma van secundaire lymfoïde organen, zoals Peyer’s patches (PPs) of mesenterische lymfeklieren, zijn waar naïeve lymfocyten antigenen voelen. Naïeve lymfocyten circuleren door de bloedbaan om hoge endotheel venules te bereiken, het portaal van binnenkomst in PPs. Sommige immunomodulatoren worden geschat om lymfocytenmigratie te beïnvloeden, maar de nauwkeurige evaluatie van microcirculatiedynamiek is zeer moeilijk, en het vaststellen van een methode om lymfocytenmigratie in vivo te observeren kan bijdragen aan de verduidelijking van de precieze mechanismen. We hebben de methode verfijnd om lymfocyten uit het lymfekanaal te verzamelen en de gedetailleerde dynamiek van darmtroeplymfocyten in rat-PPs te observeren. We kozen voor confocale laserscanmicroscopie om rat-PPs in vivo te observeren en namen het op met behulp van time-lapse-fotografie. We kunnen nu duidelijke beelden verkrijgen die kunnen bijdragen aan de analyse van de lymfocytendynamiek.
Introduction
Peyer’s patches (PPs) bestaan uit honderden lymfoïde follikels in de lamina propria van de dunne darm. PPs zijn onderverdeeld in follikels, het interfolliculaire gebied en kiemcentra in het onderste deel van de follikels, waar lymfocyten worden gestimuleerd door antigeenpresentatie. Er zijn geen afferente lymfevaten en de antigenen dringen de lamina propria van het darmlumen binnen via de epitheelcellaag. Het epitheelgebied dat lymfoïde follikels omvat, wordt het follikel-geassocieerde epitheel genoemd, waarbinnen gespecialiseerde afgewisselde M-cellen slijmvliesantigenen innemen. M-cellen nemen antigenen op van de luminale kant en antigenen worden vervolgens gevangen door dendritische cellen en gepresenteerd in de richting van naïeve lymfocyten die in PPs stromen via het endotheel van hoge endotheel venules (HEVs)1. PPs spelen een belangrijke rol in de darmimmuniteit en zijn gerelateerd aan het vroege stadium van ontsteking. Veel moleculaire interacties omvatten de ingang van lymfocyten tot secundaire lymfoïde organen (SLA’s), waaronder hechtingsmoleculen, chemokines2,3en sfingosine-1-fosfaat4; er zijn dus veel verwachte therapeutische doelen. Daarom stelt het observeren van de lymfocytendynamiek binnen PPs ons in staat om een glimp op te vangen van het zeer vroege stadium van ontsteking en het nut van verschillende veelbelovende geneesmiddelen te onderzoeken.
De methode richt zich hier op de migratie van lymfocyten in PPs, die verschillende procedures omvat (cannulatie in het thoracale kanaal5 en het verzamelen van lymfocyten en langetermijnobservatie na de injectie in verzamelde lymfocyten). Aangezien deze procedures complex zijn en het moeilijk was om precies te zien hoe elke procedure in eerdere rapporten werd uitgevoerd, hebben we hier enkele tips genoemd om tot een succesvolle observatie te komen. Cannulatie van de buizen in het thoracale kanaal was bijvoorbeeld erg moeilijk en het aanvankelijke slagingspercentage van cannulatie was minder dan 50%. We hebben de methode echter verbeterd en een slagingspercentage van meer dan 80% bereikt. We noemden enkele andere tips in dit manuscript die nodig zijn voor de succesvolle observatie om de kwantitatieve evaluatie van de transendotheliële migratie van lymfocyten onder verschillende omstandigheden mogelijk te maken.
In eerdere rapporten was het moeilijk om de driedimensionale veranderingen in de loop van de tijd te begrijpen, zoals de intraveneuze injectie van Indiase inkt om de vasculaire structuur van PPs6te bevlekken , of de microscoop die monofocaalis 7. In de afgelopen jaren heeft een observationele methode met behulp van enkele fotoconverteerbare fluorescentie-eiwittransgene dieren zoals Kaede-muizen systematische cellulaire bewegingen in vivo8verduidelijkt . De andere studie verduidelijkte cd69 onafhankelijke uitschakeling van lymfocytenuitgang van PPs9. We gebruikten confocale laser scanning microscopie (CLSM) vanwege het hoge analytische vermogen. Nu kunnen we gemakkelijk afbeeldingen met een hoge resolutie verkrijgen en ze gebruiken om de lymfocytendynamiek te analyseren.
In dit verslag hebben we een reeks methoden gedemonstreerd voor de evaluatie van lymfocytenmigratie bij PPs. Ten eerste toonden we verfijnde methoden van thoracale kanaalconnulatie om lymfocyten te verzamelen. Ten tweede hebben we de observatiemethoden op verschillende manieren verbeterd om objectieve organen waar mogelijk onder microscopische observatie te behouden, waardoor we gedurende 3 uur beelden van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen. Ten derde hebben we de cellulaire bewegingen van lymfocytenmigratie gekwantificeerd om de effecten van sommige medicijnen te evalueren. Deze gewijzigde protocollen zullen bijdragen aan de ontwikkeling van evaluaties van mucosale immunologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven we een protocol voor het verzamelen van naïeve darm-tropen lymfocyten en het observeren van hun migratie in rat PPs. Deze procedures kunnen onthullen hoe lymfocyten bewegen in de microvasculatuur van PPs en maken het mogelijk om hun dynamiek visueel te vergelijken onder een normale of medicinale aandoening. De directe observatie van deze dynamiek heeft veel verdienste om een aanwijzing te krijgen voor immunologische modificatie door sommige geneesmiddelen, hoewel de observatieperiode beperkt is tot slech…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het National Defense Medical College en een onderzoeksbeurs voor gezondheid en arbeidswetenschappen voor onderzoek naar hardnekkige ziekten van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
