תצפית מיקרוסקופית של לימפוציטים דינמיקה במדבקות של עכברוש פייר
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.
Abstract
לימפוציטים נאיביים recirculate מהדם לרקמות הלימפה במצב פיזיולוגי והוא מוכר בדרך כלל כתופעה חשובה בחסינות המעיים. הסטרומה של איברי הלימפה המשניים, כגון טלאים של פייר (PPs) או בלוטות לימפה mesenteric, הם המקום שבו לימפוציטים נאיביים חשים אנטיגנים. לימפוציטים נאיביים מסתובבים במחזור הדם כדי להגיע לצללים אנדותל גבוהים, שער הכניסה ל- PPs. כמה immunomodulators מוערך להשפיע על נדידת לימפוציטים, אבל הערכה מדויקת של דינמיקה microcirculation קשה מאוד, וקביעת שיטה להתבונן נדידת לימפוציטים vivo יכול לתרום בירור המנגנונים המדויקים. אנחנו מעודן השיטה של איסוף לימפוציטים מן צינור הלימפה והתבוננות הדינמיקה המפורטת של לימפוציטים tropic הבטן ב PPs חולדה. בחרנו מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצפות PPs חולדה vivo והקלטנו אותו באמצעות צילום זמן לשגות. עכשיו אנחנו יכולים להשיג תמונות ברורות שיכולות לתרום לניתוח של דינמיקה לימפוציטים.
Introduction
הטלאים של פייר (PPs) מורכבים ממאות זקיקי לימפואידים בפרופוריה למינה של המעי הדק. PPs מחולקים זקיקים, האזור interfollicular, ומרכזים נביטה הממוקמים בחלק התחתון של הזקיקים, שם לימפוציטים מגורים על ידי מצגת אנטיגן. אין כלי לימפה afferent, ואת האנטיגנים לפלוש פרופריה למינה מן לומן המעי דרך שכבת תא אפיתל. אזור האפיתל המכסה זקיקי הלימפה נקרא אפיתל הקשורים זקיק, שבתוכו תאי M משולבים מיוחדים ספיגת אנטיגנים ריר. תאי M לוקחים אנטיגנים מהצד הזוהר ואנטיגנים נלכדים לאחר מכן על ידי תאים דנדריטיים ומוצגים לכיוון לימפוציטים נאיביים הזורמים לתוך PPs דרך האנדותל של venules אנדותל גבוה (HEVs)1. PPs לשחק תפקיד חשוב חסינות מעיים קשורים עם השלב המוקדם של דלקת. אינטראקציות מולקולריות רבות כרוכות בכניסה של לימפוציטים לאיברים לימפואידיים משניים (SLOs), כולל מולקולות הידבקות, כימוקינים2,3, ו sphingosine-1-פוספט4; לכן, ישנם מטרות טיפוליות צפויות רבות. לכן, התבוננות בדינמיקה לימפוציטים בתוך PPs מאפשר לנו להציץ בשלב מוקדם מאוד של דלקת ולבחון את התועלת של כמה תרופות מבטיחות.
השיטה כאן מתמקדת בהגירה של לימפוציטים ב PPs, הכולל מספר הליכים (קנולציה לתוך צינור בית החזה5 ואיסוף לימפוציטים ותצפית לטווח ארוך לאחר ההזרקה לתוך לימפוציטים שנאספו). מכיוון שהליכים אלה מורכבים והיה קשה לראות בדיוק כיצד כל הליך בוצע בדוחות קודמים, הזכרנו כאן כמה טיפים להשגת התבוננות מוצלחת. לדוגמה, התבוללות של הצינורות לתוך צינור בית החזה היה קשה מאוד, ואת שיעור ההצלחה הראשונית של קנול היה פחות מ 50%. עם זאת, שיפרנו את השיטה והשגנו שיעור הצלחה העולה על 80%. הזכרנו כמה טיפים אחרים בכתב יד זה הדרושים לתצפית המוצלחת כדי לאפשר הערכה כמותית של הגירה טרנסנדותלאלית של לימפוציטים במספר תנאים.
בדיווחים קודמים, היה קשה להבין את השינויים התלת מימדיים לאורך זמן, כגון הזרקה תוך ורידי של דיו הודו כדי להכתים את מבנה כלי הדם של PPs6, או מיקרוסקופ להיות מונופוקלי7. בשנים האחרונות, שיטה תצפיתית באמצעות כמה בעלי חיים מהונדסים חלבון פלואורסצנטי פוטו-מונברט כגון עכברי קדה הבהירו תנועות תאיות שיטתיות ב vivo8. המחקר השני הבהיר CD69 כיבוי עצמאי של יציאת לימפוציטים מ PPs9. השתמשנו במיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) בגלל היכולת האנליטית הגבוהה שלה. עכשיו אנחנו יכולים בקלות להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם כדי לנתח את הדינמיקה לימפוציטים.
בדו”ח זה, הדגמנו סדרה של שיטות להערכת נדידת לימפוציטים ב- PPs. ראשית, הראינו שיטות מעודנות של קנול צינור בית החזה כדי לאסוף לימפוציטים. שנית, שיפרנו את שיטות התצפית במספר דרכים לשמירה על איברים אובייקטיביים במידת האפשר תחת השגחה מיקרוסקופית, המאפשרת לנו להשיג תמונות באיכות גבוהה במשך 3 שעות. שלישית, כימתנו את התנועות התאיות של נדידת לימפוציטים כדי להעריך את ההשפעות של תרופות מסוימות. פרוטוקולים מותאמים אלה יתרמו לפיתוח הערכות אימונולוגיה ריר.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תיארנו פרוטוקול לאיסוף לימפוציטים נאיביים במעיים ולהתבוננות בנדידתם בחולדות PPs. הליכים אלה יכולים לחשוף כיצד לימפוציטים לנוע microvasculature של PPs ומאפשרים להשוות חזותית את הדינמיקה שלהם תחת מצב נורמלי או תרופות. התצפית הישירה של דינמיקה זו יש הרבה ערך כדי לקבל רמז לשינוי חיסוני על ידי תרופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכללה הלאומית לביטחון רפואי ועל ידי מענק מחקר במדעי הבריאות והעבודה למחקר על מחלות עקשניות ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
