चूहा है Peyer पैच में लिम्फोसाइट गतिशीलता के सूक्ष्म अवलोकन
Summary
यहां, हम वक्ष वाहिनी लिम्फोसाइट्स एकत्र करने और समय-चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके 3 घंटे के लिए चूहे पेयर के पैच में आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स के प्रवास को देखने के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करते हैं। यह तकनीक स्पष्ट कर सकती है कि भड़काऊ परिस्थितियों में लिम्फोसाइट्स की गतिशीलता कैसे प्रभावित होती है।
Abstract
भोले लिम्फोसाइट्स रक्त से शारीरिक स्थिति के तहत लिम्फोइड ऊतकों को फिर से प्रसारित करते हैं और इसे आमतौर पर आंत प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण घटना के रूप में पहचाना जाता है। माध्यमिक लिम्फोइड अंगों का स्ट्रोमा, जैसे कि पेयर के पैच (पीपीएस) या मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, जहां भोले लिम्फोसाइट्स सेंस एंटीजन हैं। भोले लिम्फोसाइट्स पीपीएस में प्रवेश के पोर्टल उच्च एंडोथेलियल वेणुल्स तक पहुंचने के लिए खून के माध्यम से प्रसारित होते हैं। कुछ इम्यूनोमोडुलेटर्स को लिम्फोसाइट माइग्रेशन को प्रभावित करने का अनुमान है, लेकिन माइक्रोसर्कुलेशन गतिशीलता का सटीक मूल्यांकन बहुत मुश्किल है, और वीवो में लिम्फोसाइट माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए एक विधि स्थापित करना सटीक तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान दे सकता है। हमने लिम्फोसाइट्स को लिम्फोसाइट्स को लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने और चूहे के पीपीएस में आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स की विस्तृत गतिशीलता को देखते हुए परिष्कृत किया। हमने वीवो में चूहे के पीपीएस का निरीक्षण करने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी को चुना और समय-चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके इसे रिकॉर्ड किया। अब हम स्पष्ट छवियां प्राप्त कर सकते हैं जो लिम्फोसाइट गतिशीलता के विश्लेषण में योगदान दे सकते हैं।
Introduction
पीयर के पैच (पीपीएस) में छोटी आंत के लैमिना प्रोपरिया में सैकड़ों लिम्फोइड रोम शामिल हैं। पीपीएस को रोम, इंटरफोलिकुलर क्षेत्र और रोम के निचले हिस्से में स्थित अंकुरित केंद्रों में विभाजित किया जाता है, जहां लिम्फोसाइट्स एंटीजन प्रस्तुति द्वारा उत्तेजित होते हैं। कोई अफरेंट लिम्फेटिक जहाज नहीं हैं, और एंटीजन एपिथेलियल सेल परत के माध्यम से आंतों के लुमेन से लैमिना प्रोप्रिया पर आक्रमण करते हैं। लिम्फोइड कूप को कवर करने वाले एपिथेलियल क्षेत्र को कूप से जुड़े एपिथेलियम कहा जाता है, जिसके भीतर विशेष इंटरस्प्रेड एम कोशिकाएं म्यूकोसल एंटीजन को तेज करती हैं। एम कोशिकाएं ल्यूमिनल साइड से एंटीजन में लेती हैं और एंटीजन को फिर डेंड्रिटिक कोशिकाओं द्वारा कैप्चर किया जाता है और भोले लिम्फोसाइट्स की ओर प्रस्तुत किया जाता है जो उच्च एंडोथेलियल वेणुल्स (एचईवी)1के एंडोथेलियम के माध्यम से पीपीएस में प्रवाहित होते हैं। पीपीएस आंतों की प्रतिरक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सूजन के प्रारंभिक चरण से संबंधित हैं। कई आणविक बातचीत में लिम्फोसाइट्स के प्रवेश द्वार को माध्यमिक लिम्फोइड अंगों (एसएलओ) में शामिल किया जाता है, जिसमें आसंजन अणु, केमोकिंस2,3और स्कोफिंगोसाइन-1-फॉस्फेट4शामिल हैं; इस प्रकार, कई अपेक्षित चिकित्सीय लक्ष्य हैं। इसलिए, पीपीएस के भीतर लिम्फोसाइट गतिशीलता को देखने से हम सूजन के प्रारंभिक चरण की एक झलक पकड़ने और कई आशाजनक दवाओं की उपयोगिता की जांच करने में सक्षम होते हैं।
यहां की विधि पीपीएस में लिम्फोसाइट्स के प्रवास पर केंद्रित है, जिसमें कई प्रक्रियाएं (वक्ष वाहिनी5 में कैनुलेशन और एकत्र लिम्फोसाइट्स में इंजेक्शन के बाद लिम्फोसाइट्स और दीर्घकालिक अवलोकन एकत्र करना) शामिल है। चूंकि ये प्रक्रियाएं जटिल हैं और यह देखना मुश्किल था कि पिछली रिपोर्टों में प्रत्येक प्रक्रिया का प्रदर्शन कैसे किया गया था, इसलिए हमने यहां एक सफल अवलोकन प्राप्त करने के लिए कुछ सुझावों का उल्लेख किया । उदाहरण के लिए, वक्ष वाहिनी में ट्यूबों का कैनुलेशन बहुत मुश्किल था, और कैनुलेशन की प्रारंभिक सफलता दर 50% से कम थी। हालांकि, हमने विधि में सुधार किया और 80% से अधिक सफलता दर हासिल की। हमने इस पांडुलिपि में कुछ अन्य सुझावों का उल्लेख किया है जो सफल अवलोकन के लिए आवश्यक हैं ताकि कई शर्तों के तहत लिम्फोसाइट्स के ट्रांसेंडोथेलियल माइग्रेशन का मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सके।
पिछली रिपोर्टों में, समय के साथ त्रि-आयामी परिवर्तनों को समझना मुश्किल था, जैसे कि भारत की स्याही का नसों में इंजेक्शन पीपीएस6की संवहनी संरचना को दागना, या माइक्रोस्कोप मोनोफोकल7। हाल के वर्षों में, कुछ फोटोवर्टिबल फ्लोरेसेंस प्रोटीन ट्रांसजेनिक जानवरों जैसे कादे चूहों का उपयोग करके एक अवलोकन विधि ने वीवो8में व्यवस्थित सेलुलर आंदोलनों को स्पष्ट किया है। अन्य अध्ययन में पीपीएस9से लिम्फोसाइट एग्रेस के सीडी 69 स्वतंत्र शटडाउन को स्पष्ट किया गया । हमने अपनी उच्च विश्लेषणात्मक क्षमता के कारण कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग किया। अब हम आसानी से उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त कर सकते हैं और लिम्फोसाइट गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।
इस रिपोर्ट में, हमने पीपीएस में लिम्फोसाइट माइग्रेशन के मूल्यांकन के लिए कई तरीकों का प्रदर्शन किया । सबसे पहले, हमने लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए वक्ष वाहिनी कैनुलेशन के परिष्कृत तरीके दिखाए। दूसरा, हमने सूक्ष्म अवलोकन के तहत जब भी संभव हो वस्तुनिष्ठ अंगों को बनाए रखने के लिए कई तरीकों से अवलोकन विधियों में सुधार किया, जिससे हम 3 घंटे के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त कर सकें। तीसरा, हमने कुछ दवाओं के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए लिम्फोसाइट माइग्रेशन के सेलुलर आंदोलनों की मात्रा निर्धारित की। ये संशोधित प्रोटोकॉल म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी मूल्यांकनों के विकास में योगदान देंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हमने भोले आंत-रेखा लिम्फोसाइट्स को इकट्ठा करने और चूहे के पीपीएस में उनके प्रवास को देखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। इन प्रक्रियाओं से पता चल सकता है कि लिम्फोसाइट्स पीपीएस के माइक्रोवैस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय रक्षा मेडिकल कॉलेज से अनुदान और स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय, जापान से असभ्य रोगों पर अनुसंधान के लिए एक स्वास्थ्य और श्रम विज्ञान अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
