Mikroskopisk observasjon av lymfocyttdynamikk i Rotte Peyers patcher

Summary

Her beskriver vi en presis metode for å samle thoraxkanallymfocytter og observere migrering av tarmtropiske lymfocytter hos rotte Peyers patcher i 3 timer ved hjelp av time-lapse fotografering. Denne teknikken kan avklare hvordan dynamikken i lymfocytter påvirkes under inflammatoriske forhold.

Abstract

Naive lymfocytter resirkulerer fra blodet til lymfoidvevet under fysiologisk tilstand, og det er ofte anerkjent som et viktig fenomen i tarmimmuniteten. Stroma av sekundære lymfoide organer, som Peyers patcher (PPer) eller mesenteriske lymfeknuter, er der naive lymfocytter registrerer antigener. Naive lymfocytter sirkulerer gjennom blodet for å nå høye endotel venules, portalen for inntreden i PPs. Noen immunmodulatorer er anslått å påvirke lymfocyttmigrasjon, men den nøyaktige evalueringen av mikrosirkulasjonsdynamikk er svært vanskelig, og etablering av en metode for å observere lymfocyttmigrasjon in vivo kan bidra til avklaring av de nøyaktige mekanismene. Vi raffinerte metoden for å samle lymfocytter fra lymfekanalen og observere den detaljerte dynamikken i tarmtropiske lymfocytter hos rotte-PPer. Vi valgte konfokal laserskanning mikroskopi for å observere rotte PPs in vivo og registrert den ved hjelp av time-lapse fotografering. Vi kan nå få klare bilder som kan bidra til analyse av lymfocyttdynamikk.

Introduction

Peyers patcher (PPer) består av hundrevis av lymfoide follikler i laminapropria i tynntarmen. PPs er delt inn i follikler, den interfollicular regionen, og germinal sentre som ligger i den nedre delen av folliklene, hvor lymfocytter stimuleres av antigenpresentasjon. Det er ingen afferent lymfatiske kar, og antigenene invaderer lamina propria fra tarmlumen via epitelcellelaget. Epitelregionen som dekker lymfoide follikler kalles follikkel-assosiert epitel, der spesialiserte ispedd M-celler tar opp slimhinneantigener. M celler tar i antigener fra luminalsiden og antigener blir deretter fanget av dendrittiske celler og presentert mot naive lymfocytter som strømmer inn i PPer gjennom endotelet av høye endotel venules (HEVs)¹. PPs spiller en viktig rolle i tarmimmunitet og er relatert til det tidlige stadiet av betennelse. Mange molekylære interaksjoner involverer inngangen til lymfocytter til sekundære lymfoide organer (SFO), inkludert vedheftmolekyler, chemokines^2,3og sphingosine-1-fosfat⁴; Dermed er det mange forventede terapeutiske mål. Derfor, observere lymfocytt dynamikken i PPs gjør oss i stand til å få et glimt av den svært tidlige fasen av betennelse og undersøke nytten av flere lovende legemidler.

Metoden her fokuserer på migrering av lymfocytter hos PPer, som inkluderer flere prosedyrer (kanylering i thoraxkanalen⁵ og innsamling av lymfocytter og langsiktig observasjon etter injeksjonen i innsamlede lymfocytter). Siden disse prosedyrene er komplekse og det var vanskelig å se nøyaktig hvordan hver prosedyre ble utført i tidligere rapporter, nevnte vi her noen tips for å oppnå en vellykket observasjon. For eksempel var hermetikk av rørene i thoraxkanalen svært vanskelig, og den første suksessraten for hermetikk var mindre enn 50%. Vi forbedret imidlertid metoden og oppnådde en suksessrate over 80%. Vi nevnte noen andre tips i dette manuskriptet som er nødvendige for vellykket observasjon for å muliggjøre kvantitativ evaluering av transendothelial migrasjon av lymfocytter under flere forhold.

I tidligere rapporter var det vanskelig å forstå de tredimensjonale endringene over tid, for eksempel intravenøs injeksjon av India-blekk for å flekke den vaskulære strukturen til PPs⁶, eller mikroskopet er monofokal⁷. I de senere årene har en observasjonsmetode ved hjelp av noen fotokonvertible fluorescensproteintransgene dyr som Kaede-mus avklart systematiske cellulære bevegelser in vivo⁸. Den andre studien avklart CD69 uavhengig nedleggelse av lymfocytt utgående fra PPs⁹. Vi brukte konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) på grunn av sin høye analytiske evne. Nå kan vi enkelt få høyoppløselige bilder og bruke dem til å analysere lymfocyttdynamikk.

I denne rapporten demonstrerte vi en rekke metoder for evaluering av lymfocyttmigrasjon i PPer. Først viste vi raffinerte metoder for thoraxkanal cannulation for å samle lymfocytter. For det andre forbedret vi observasjonsmetodene på flere måter for å opprettholde objektive organer når det er mulig under mikroskopisk observasjon, slik at vi kan få bilder av høy kvalitet i 3 timer. For det tredje kvantifiserte vi cellulære bevegelser av lymfocyttmigrasjon for å evaluere effekten av noen medisiner. Disse modifiserte protokollene vil bidra til utvikling av slimhinneimmunologievalueringer.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Research Committee of National Defense Medical College (nr. 16058). Dyrene ble opprettholdt på standard laboratoriemat (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). Laboratoriedyrene ble behandlet i henhold til Nasjonale helseinstitutter. 1. Innsamling og separasjon av lymfocytter MERK: Siden lymfocytter må være friske og ikke kan lagres, må de samles inn fra rotter for hvert eksperiment. I tillegg må tarmtropiske lymfocyt…

Representative Results

Innsamling av lymfocytter fra lymfeFor å forberede rotten for thoraxkanal cannulation, gjør et snitt i den spente thoraxkanalen som vist i figur 1 og deretter opprettholde rotten i en Bollmanbur som vist i figur 2. Når lymfocytter er godt samlet, kan vi få ca 20 ml / 6 h lymfevæske som inneholder ca 107~ 108/ ml lymfocytter. Av TDLs, 70% express CD4, blant annet ca 90% celler uttrykke CD…

Discussion

Her beskrev vi en protokoll for innsamling av naive tarmtropiske lymfocytter og observere deres migrasjon hos rotte-PPer. Disse prosedyrene kan avsløre hvordan lymfocytter beveger seg i mikrovaskulaturen av PPer og gjør det mulig å visuelt sammenligne dynamikken under en normal eller medisinert tilstand. Den direkte observasjonen av disse dynamikkene har mye fortjeneste for å få en anelse om immunologisk modifikasjon av noen stoffer, selv om observasjonsperioden er begrenset til bare noen få timer.

<p class="jo…

Materials

A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 medium	GIBCO	11875093
Texas Red–dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863