Mikroskopisk observation av lymfocytdynamik i Rat Peyer's Patches
Summary
Här beskriver vi en exakt metod för att samla bröst trumman lymfocyter och observera migrationen av gut-tropiska lymfocyter i råtta Peyers fläckar i 3 timmar med tidsfördröjning fotografering. Denna teknik kan klargöra hur dynamiken hos lymfocyter påverkas under inflammatoriska förhållanden.
Abstract
Naiva lymfocyter återcirkulerar från blodet till lymfoida vävnader under fysiologiskt tillstånd och det är allmänt erkänt som ett viktigt fenomen i tarmimmuniteten. Stromen av sekundära lymfoida organ, såsom Peyers fläckar (PPs) eller mesenteriala lymfkörtlar, är där naiva lymfocyter känner antigener. Naiva lymfocyter cirkulerar genom blodomloppet för att nå höga endotel venuler, portalen för inträde i PPs. Vissa immunmodulatorer uppskattas påverka lymfocytmigration, men den exakta utvärderingen av mikrocirkulationsdynamiken är mycket svår, och att fastställa en metod för att observera lymfocytmigration in vivo kan bidra till klargörandet av de exakta mekanismerna. Vi förfinade metoden att samla lymfocyter från lymfkanalen och observera den detaljerade dynamiken i gut-tropic lymfocyter i råtta PPs. Vi valde confocal laser scanning mikroskopi för att observera råtta PPs in vivo och spelade in det med tidsfördröjning fotografering. Vi kan nu få tydliga bilder som kan bidra till analysen av lymfocytdynamik.
Introduction
Peyers fläckar (PPs) består av hundratals lymfoida folliklar i tunntarmens lamina propria. PPs är indelade i folliklar, interfollicular regionen och germinal centers ligger i den nedre delen av folliklarna, där lymfocyter stimuleras av antigen presentation. Det finns inga afferenta lymfkärl, och antigenerna invaderar lamina propria från tarmlumen via epitelcellskiktet. Epitelregionen som täcker lymfoida folliklar kallas follikel-associerade epitel, inom vilken specialiserade interspersed M celler upptag mucosal antigener. M-celler tar in antigener från den luminala sidan och antigener fångas sedan av dendritiska celler och presenteras mot naiva lymfocyter som strömmar in i PPs genom endotel av höga endotel venuler (HEVs)1. PPs spelar en viktig roll i tarmimmunitet och är relaterade till det tidiga stadiet av inflammation. Många molekylära interaktioner innebär ingången av lymfocyter till sekundära lymfoida organ (SLOs), inklusive vidhäftningsmolekyler, kemokiner2,3, och sphingosine-1-fosfat4; således finns det många förväntade terapeutiska mål. Därför, observera lymfocytdynamiken inom PPs gör det möjligt för oss att få en glimt av det mycket tidiga skedet av inflammation och undersöka nyttan av flera lovande läkemedel.
Metoden här fokuserar på migration av lymfocyter i PPs, som innehåller flera förfaranden (cannulation i bröstkanalen5 och samla lymfocyter och långsiktig observation efter injektionen i insamlade lymfocyter). Eftersom dessa förfaranden är komplexa och det var svårt att se exakt hur varje förfarande utfördes i tidigare rapporter, nämnde vi här några tips för att uppnå en framgångsrik observation. Till exempel var cannulation av rören i bröstkanalen mycket svårt, och den ursprungliga framgångsgraden för cannulation var mindre än 50%. Vi förbättrade dock metoden och uppnådde en framgångsgrad som översteg 80 procent. Vi nämnde några andra tips i detta manuskript som är nödvändiga för framgångsrik observation för att möjliggöra kvantitativ utvärdering av transendotelial migration av lymfocyter under flera förhållanden.
I tidigare rapporter var det svårt att förstå de tredimensionella förändringarna över tiden, såsom intravenös injektion av Indien bläck för att färga kärlstrukturen hos PPs6, eller mikroskopet är monofokal7. Under de senaste åren har en observationsmetod med hjälp av vissa fotokonverterbara fluorescensproteintransgena djur som Kaede möss klargjort systematiska cellulära rörelser in vivo8. Den andra studien klargjorde CD69 oberoende avstängning av lymfocyt utgående från PPs9. Vi använde confocal laser scanning mikroskopi (CLSM) på grund av dess höga analytiska förmåga. Nu kan vi enkelt få högupplösta bilder och använda dem för att analysera lymfocytdynamik.
I detta betänkande visade vi en rad metoder för att utvärdera lymfocyt migration i PPs. Först visade vi raffinerade metoder för bröst trumman cannulation för att samla lymfocyter. För det andra förbättrade vi observationsmetoderna på flera sätt för att upprätthålla objektiva organ när det var möjligt under mikroskopisk observation, vilket gjorde det möjligt för oss att få högkvalitativa bilder i 3 timmar. För det tredje kvantifierade vi cellulära rörelser av lymfocytmigration för att utvärdera effekterna av vissa mediciner. Dessa ändrade protokoll kommer att bidra till utvecklingen av mucosal immunologi utvärderingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrev vi ett protokoll för att samla naiva gut-tropic lymfocyter och observera deras migration i råtta PPs. Dessa förfaranden kan avslöja hur lymfocyter rör sig i mikrovaskulaturen av PPs och göra det möjligt att visuellt jämföra deras dynamik under ett normalt eller medicinerat tillstånd. Den direkta observationen av denna dynamik har mycket fördelar att få en ledtråd för immunologiska modifiering av vissa läkemedel, även om observationsperioden är begränsad till endast några timmar.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av bidrag från National Defense Medical College och av ett forskningsanslag för hälso- och arbetsvetenskap för forskning om svårbehandlade sjukdomar från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd, Japan.
Materials
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
References
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer’s Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer’s Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer’s patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
