Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van een Xenotransplantatie Model
Summary
In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Met behulp van soortspecifieke primers werd cpsDNA door qPCR gekwantificeerd in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en varkens-tot-aap slagaderpatch transplantatiemodellen.
Abstract
Xenotransplantatie is een haalbare methode om orgaanfalen te behandelen. Echter, hoe effectief te controleren van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en onderzoekers. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en effectieve methode om immuunafstoting te controleren in celtransplantatiemodellen van varkens tot muis en patchtransplantatiemodellen van varkens tot aap. Circulerend DNA is een potentieel niet-invasieve biomarker voor orgaanschade. In deze studie werd circulerend varkensspecifiek DNA (cpsDNA) gemonitord tijdens xenograft afwijzing door kwantitatieve real-time PCR (qPCR). In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Soortenspecifieke primers werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch transplantatiemodellen. De waarde van deze methode suggereert dat het kan worden gebruikt als een eenvoudige, handige, lage kosten, en minder invasieve methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.
Introduction
Orgaanfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken1. Transplantatie van cellen, weefsels en organen is een effectieve manier om orgaanfalen te behandelen2. Niettemin beperkt het tekort aan donororganen de klinische toepassing van deze methode3,4. Studies hebben aangetoond dat varkens kunnen worden gebruikt als een potentiële bron van menselijke organen voor klinische transplantatie5,6. Echter, kruissoorten orgaantransplantatie gezichten gevaarlijke immuunafstoting. Daarom is het cruciaal om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Momenteel is de klinische monitoring van immuunafstoting voornamelijk afhankelijk van de tekenen en symptomen van de patiënt, evenals laboratoriumtests (bijvoorbeeld biopsie, immunobiochemische analyse en echografie)7,8,9. Deze bewakingsmethoden hebben echter veel nadelen. De tekenen en symptomen van immuunafstoting bij patiënten verschijnen meestal laat10, wat niet bevorderlijk is voor vroegtijdige opsporing en vroegtijdige interventie; biopsie heeft het nadeel invasieve11, wat niet gemakkelijk is voor patiënten te accepteren; immunobiochemische analyse mist gevoeligheid of specificiteit, en echografie is hulp en duur. Daarom is het dringend noodzakelijk om een effectieve en handige methode te vinden om de immuunafstoting te controleren.
Circulerend DNA is een extracellulair type DNA gevonden in bloed. Mandel en Metais12 meldden voor het eerst de aanwezigheid van circulerend DNA in perifeer bloed in 1948. Onder normale fysiologische omstandigheden is circulerend DNA in het bloed van gezonde mensen relatief laag bij aanvang. Echter, in sommige pathologieën, zoals tumoren, hartinfarct, auto-immuunziekten, en transplantatie afwijzing, het niveau van circulerende DNA in het bloed kan aanzienlijk worden verhoogd13,14 als gevolg van de massale afgifte van circulerend DNA veroorzaakt door apoptose en necrose. De oorsprong van circulerend DNA wordt geassocieerd met apoptose en necrose15, die kenmerkend zijn voor xenograftafstotie16.
Circulerend DNA is bewezen een minimaal invasieve biomarker te zijn voor het opsporen van kanker17,18,19. Hoge door-put sequencing van donor-afgeleid circulerend DNA is betrouwbaar voor de opsporing van afstoting na orgaantransplantatie20,21. Deze methode vereist echter een hoge concentratie en kwaliteit van geëxtraheerd DNA. De DNA-eisen in aanvulling op de hoge kosten en tijd-consumptie maken deze methode niet in aanmerking voor routinematig klinisch gebruik. Donor-afgeleid circulerend DNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door kwantitatieve real-time PCR (qPCR), die zowel specifiek als gevoelig is. Daarom is het kwantificeren van varkens die DNA doorgeven door qPCR een haalbare methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren. Dit is minder invasief, zeer gevoelig en specifiek, lage kosten en tijdbesparend. Varkens en mensen zijn genetisch gescheiden met heel verschillende genomische sequenties(figuur 1). Daarom kan circulerend varkens-DNA worden vrijgegeven in het bloed van de ontvanger na de xenotransplantatie als gevolg van xeno-afwijzing. CpsDNA kan nauwkeurig worden gekwantificeerd door qPCR met soortspecifieke primers in het bloed van de ontvanger. Eerder hebben we de beweegredenen en haalbaarheid van cpsDNA als biomarker voor xenotransplantatie22,23aangetoond . Hier onthullen we meer experimentele tips en details. Het experiment bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste werden varkensspecifieke primers ontworpen en werd genomisch DNA geïsoleerd, die werden gebruikt om de specificiteit van de primers te verifiëren door reguliere PCR. Ten tweede, de bouw van de standaardcurve van cpsDNA en het isoleren van cpsDNA uit het monsterbloed. Ten slotte werd het circulerende varkensspecifieke DNA gekwantificeerd met behulp van qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het kwantificeren van varkens dat circulerend DNA circuleert, is een haalbare aanpak om de immuunafstoting van xenotransplantatie te monitoren. Gadi et al.24 vonden dat het circulatie-DNA(ddcfDNA) van donoren in het bloed van patiënten met acute afstoting aanzienlijk hoger was dan dat van patiënten zonder afstoting. Deze studies suggereren dat ddcfDNA kan een gemeenschappelijke biomarker voor het toezicht op orgaantransplantatie schade. In de afgelopen jaren is qPCR steeds meer toegepast op de a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangd provincie (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds voor high level medical discipline bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
