Количественная оценка циркулирующей ДНК свиней в крови модели ксенотрансплантации
Summary
В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Используя вид-специфические грунтовки, cpsDNA было количественно qPCR в моделях трансплантации клетки свиньи к мыши и свинья-к-обезьяна модели трансплантации артерии.
Abstract
Ксенотрансплантация является возможным методом лечения органной недостаточности. Однако, как эффективно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации является проблемой для врачей и исследователей. В этой рукописи описывается простой и эффективный метод мониторинга иммунного отторжения в моделях трансплантации клеток от свиньи до мыши и моделях трансплантации патчей от свиньи к обезьяне. Циркулирующая ДНК является потенциально неинвазивным биомаркером для повреждения органов. В этом исследовании, циркулирующих свиней конкретных ДНК (cpsDNA) был мониторинг во время ксенотрансплантата отторжения количественных ПЦР в режиме реального времени (qPCR). В этом протоколе были разработаны свиные специфические грунтовки, построены плазмиды, содержащие свиные фрагменты ДНК, и установлены стандартные кривые для количественной оценки. Вид-специфические грунтовки затем были использованы для количественной cpsDNA по qPCR в свинью к мыши модели трансплантации клеток и свиньи до обезьяны артерии патч трансплантации моделей. Значение этого метода предполагает, что он может быть использован в качестве простого, удобного, недорогого и менее инвазивного метода для мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации.
Introduction
Органная недостаточность является одной из основных причин смерти1. Трансплантация клеток, тканей и органов является эффективным способом лечения органной недостаточности2. Тем не менее, нехватка донорских органов ограничивает клиническое применение этогометода 3,4. Исследования показали, что свиньи могут быть использованы в качестве потенциального источника человеческих органов для клиническойтрансплантации 5,6. Однако пересадка меж вида органов сталкивается с опасным иммунным отторжением. Поэтому крайне важно контролировать иммунный отказ от ксенотрансплантации. В настоящее время клинический мониторинг иммунного отторжения в основном зависит от признаков и симптомов пациента, а также лабораторных тестов (например, биопсия, иммунобиохимический анализ иУЗИ) 7,8,9. Однако эти методы мониторинга имеют много недостатков. Признаки и симптомы иммунного отторжения у пациентов обычнопоявляются поздно 10, что не способствует раннему выявлению и раннему вмешательству; биопсия имеет недостаток бытьинвазивным 11, что не легко для пациентов, чтобы принять; иммунобиохимический анализ не хватает чувствительности или специфичности, а УЗИ является вспомогательным и дорогостоящим. Поэтому необходимо срочно найти эффективный и удобный метод контроля иммунного отторжения.
Циркулирующая ДНК является внеклеточным типом ДНК, найденной в крови. Мандель и Метаис12 впервые сообщили о наличии циркулирующей ДНК в периферической крови в 1948 году. В нормальных физиологических условиях, циркулирующих ДНК в крови здоровых людей является относительно низким на базовом уровне. Однако, в некоторых патологиях, таких как опухоли, инфаркт миокарда, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантации, уровень циркулирующей ДНК вкрови может быть значительно увеличен на 13,14 из-за массового высвобождения циркулирующей ДНК, вызванной апоптозом и некрозом. Происхождение циркулирующей ДНК связано с апоптозом и некрозом15,которые характерны для отторжения ксенотрансплантата16.
Циркулирующие ДНК было доказано, что минимально инвазивных биомаркер для обнаружениярака 17,18,19. Высокое секвенирование циркулирующей ДНК доноров является надежным для выявления отторжения послетрансплантации органов 20,21. Однако этот метод требует высокой концентрации и качества извлеченной ДНК. Требования к ДНК в дополнение к высокой стоимости и времени потребления делают этот метод неподходящим для регулярного клинического использования. Циркулирующая ДНК, полученная донорами, может быть точно количественно оценена количественным ПЦР в режиме реального времени (qPCR), который является одновременно специфическим и чувствительным. Таким образом, количественная оценка свиной циркулирующей ДНК с помощью qPCR является возможным методом мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации. Это менее инвазивные, очень чувствительные и конкретные, низкая стоимость, и экономия времени. Свиньи и люди генетически отделены с совершенно разными геномными последовательностями(рисунок 1). Таким образом, циркулирующая ДНК свинины может быть выпущена в кровь получателя после ксенотрансплантации из-за ксено-отторжения. CpsDNA может быть точно количественно qPCR с видом конкретных грунтовки в крови получателя. Ранее мы продемонстрировали обоснование и осуществимость CPSDNA в качестве биомаркера для ксенотрансплантации22,23. Здесь мы раскрываем более экспериментальные советы и детали. Эксперимент состоит из следующих шагов. Во-первых, были разработаны свиные специфические грунтовки, и геномная ДНК была изолирована, которые использовались для проверки специфичности грунтовки обычным ПЦР. Во-вторых, построение стандартной кривой cpsDNA и изоляции cpsDNA от образца крови. Наконец, циркулирующая ДНК свиней была количественно оценена с помощью qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка распространяемой ДНК свиней представляет собой осуществимый подход к мониторингу иммунного отторжения ксенотрансплантации. Гади и др.24 обнаружили, что содержание циркулирующей ДНК (ddcfDNA) в крови пациентов с острым отторжением было значительно выше,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национальной ключевой программы НИОКР Китая (2017YFC1103704), Шэньчжэньского фонда науки и техники (JCYJ20170817172116272), специальных фондов для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019), Санминг-проект медицины в Шэньчжэне (SSM201412020), Фонд высокого уровня медицинской дисциплины Строительство Шэньчжэня (2016031638), Шэньчжэнь Фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии (S’XJ2017021 , S’XJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
