Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi
Summary
Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türe özgü astarlar kullanılarak, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde cpsDNA qPCR ile ölçüldü.
Abstract
Xenotransplanttransplantorgan yetmezliği tedavisinde uygulanabilir bir yöntemdir. Ancak knenotransplantasyonun immün reddinin nasıl etkin bir şekilde izlenilen bir sorundur. Bu el yazması domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-monkey arter yama transplantasyon modellerinde bağışıklık reddi izlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklar. Dolaşımdaki DNA organ hasarı için potansiyel olarak non-invaziv bir biyobelirteçtir. Bu çalışmada, dolaşımdaki domuza özgü DNA (cpsDNA) kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından ksenogreft reddi sırasında izlendi. Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türlere özgü astarlar daha sonra domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde qPCR ile cpsDNA’yı ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin değeri, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Organ yetmezliği ölüm ana nedenlerinden biridir1. Hücre, doku ve organ nakli organ yetmezliği ni tedavi etmenin etkili bir yoludur2. Bununla birlikte, donör organların sıkıntısı bu yöntemin klinik uygulamasınırlar 3,4. Çalışmalar domuz klinik transplantasyon için insan organlarının potansiyel bir kaynak olarak kullanılabilir göstermiştir5,6. Ancak türler arası organ nakli tehlikeli bağışıklık reddi ile karşı karşıya. Bu nedenle knenotransplantasyonun immün reddini izlemek çok önemlidir. Şu anda, immün ret klinik izleme hastanın belirti ve semptomları, yanı sıra laboratuvar testleri (örneğin, biyopsi, immünobiyokimyasal analiz ve ultrason)7,8,9bağlıdır. Ancak, bu izleme yöntemleribirçok dezavantajları vardır. Hastalarda immün ret belirti ve belirtileri genellikle geç görünür10, erken teşhis ve erken müdahale için elverişli değildir; biyopsi invaziv olma dezavantajı vardır11, hangi hastalar için kabul etmek kolay değildir; immünobiyokimyasal analiz duyarlılık veya özgüllük yoksun, ve ultrason yardımcı ve pahalı. Bu nedenle, bağışıklık reddi izlemek için etkili ve uygun bir yöntem bulmak için acildir.
Dolaşımdaki DNA, kanda bulunan hücre dışı bir DNA türüdür. Mandel ve Metais12 ilk olarak 1948 yılında periferik kanda dolaşan DNA varlığını rapor ettiler. Normal fizyolojik koşullar altında, sağlıklı insanların kanında dolaşan DNA’nın taban çizgisi nispeten düşüktür. Ancak, tümörler, miyokard enfarktüsü, otoimmün hastalıklar ve nakil reddi gibi bazı patolojilerde, kandaki dolaşımdaki DNA düzeyi apopoz ve nekrozun neden olduğu dolaşımdaki DNA’nın büyük salınımı nedeniyle önemli ölçüde artabilir13,14. Dolaşan DNA’nın kökeni apoptoz ve nekroz ile ilişkilidir15, ksenogreft ret özelliği olan16.
Dolaşan DNA kanserleri tespit etmek için minimal-invaziv biyomarker olduğu kanıtlanmıştır17,18,19. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA’nın yüksek yoluyla dizilişi organ nakli sonrası ret tespiti için güvenilirdir20,21. Ancak, bu yöntem yüksek konsantrasyon ve çıkarılan DNA kalitesi gerektirir. Yüksek maliyet ve zaman tüketimine ek olarak DNA gereksinimleri bu yöntemi rutin klinik kullanım için uygun hale getirememaktadır. Donör kaynaklı sirkülasyon DNA tam kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), hem özel hem de hassas tarafından ölçülebilir. Bu nedenle, qPCR ile dolaşan domuz eti nin ölçülmesi ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yöntemdir. Bu daha az invaziv, son derece hassas ve özel, düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlar. Domuzlar ve insanlar genetik olarak oldukça farklı genomik dizilerle ayrılırlar (Şekil 1). Bu nedenle, dolaşan domuz DNA kseno-reddi nedeniyle alıcının kan post-ksenotransplantasyon içine serbest bırakılabilir. CpsDNA, qPCR tarafından alıcının kanında türe özgü astarlarla kesin olarak ölçülebilir. Daha önce, biz kzsiztransplantasyon22,23için bir biyomarker olarak cpsDNA mantığı ve fizibilite göstermiştir. Burada, daha deneysel ipuçları ve ayrıntıları ifşa. Deneme aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, domuz spesifik astarlar tasarlanmış ve genomik DNA izole edildi, hangi normal PCR tarafından astar özgüllüğünü doğrulamak için kullanıldı. İkinci olarak, cpsDNA standart eğrisi inşa ve örnek kan cpsDNA izole. Son olarak, dolaşan domuz özgü DNA qPCR kullanılarak ölçüldü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Domuz dolaşan DNA’nın ölçülmesi, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yaklaşımı temsil eder. Gadi ve ark.24, akut ret olan hastaların kanında donör kaynaklı dolaşım DNA (ddcfDNA) içeriğinin reddedilmeden hastalarınkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu buldular. Bu çalışmalar ddcfDNA’nın organ grefthasarının izlenmesinde ortak bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir. Son yıllarda qPCR, basit çalışması, yüksek otom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCYJ20170817172116272), Guang’daki Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar tarafından desteklenmiştir. Dong Eyaleti (2019), Shenzhen Tıp Sanming Projesi (SZSM201412020), Shenzhen Yüksek Düzeyli Tıbbi Disiplin İnşaat Fonu (2016031638), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
