Silicium nanowires og optisk stimulation til undersøgelser af intra- og intercellulær elektrisk kobling
Summary
Denne protokol beskriver brugen af silicium nanowires til intracellulær optisk bio-modulering af celle i en enkel og nem at udføre metode. Teknikken er meget tilpasningsdyg til forskellige celletyper og kan bruges til in vitro såvel som in vivo applikationer.
Abstract
Myofibroblasts kan spontant internalisere silicium nanowires (SiNWs), hvilket gør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikationer. Disse celle-silicium hybrider tilbyder blyfri optisk modulering kapaciteter med minimal tivitet til normal celle adfærd. De optiske kapaciteter opnås ved de fototermiske og fotoelektriske egenskaber af SiNWs. Disse hybrider kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og derefter anvendes til forskellige biologiske scenarier. Vi demonstrerer her, hvordan disse hybrider kan bruges til at studere den elektriske kobling af hjerteceller og sammenligne, hvordan myofibroblaster par til hinanden eller til kardiomyocytter. Denne proces kan udføres uden særligt udstyr ud over et fluorescerende mikroskop med koblet laserlinje. Også vist er brugen af en specialbygget MATLAB rutine, der gør det muligt kvantificering af calcium formering inden for og mellem de forskellige celler i kulturen. Myofibroblaster er vist sig at have en langsommere elektrisk respons end kardiomyocytter. Desuden myofibroblast intercellulær formering viser lidt langsommere, men sammenlignelige hastigheder til deres intracellulære hastigheder, hvilket tyder passiv formering gennem hul kryds eller nanorør. Denne teknik er meget fleksibel og kan nemt anvendes til andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøgelser.
Introduction
Alle biologiske organismer bruger elektricitet, i form af ioner, til at regulere den cellulære adfærd. Cellemembraner indeholder forskellige typer af specifikke ionkanaler, der muliggør passiv og aktiv transport af ioner. Disse ioner regulerer funktionerne af excitable celler, såsom neuronal aktivitet og skelet-og hjertemusklen kontraktilitet. Men bioelektricitet spiller også en vigtig rolle i ikke-excitable celler, der regulerer mange cellulære funktioner såsom celleproliferation1, neuroimmunity2,3,4, og stamceller differentiering5.
I de seneste årtier har bioelektriciteten vakt stigende interesse, hvilket har bidraget til udviklingen af en lang række teknologier til bioelektroniske grænseflader. Mikroelektrode patch pipetter er guldstandarden for intracellulær optagelse og stimulering6. I denne metode trækkes en glaspipette under særlige forhold for at danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikron. Denne pipette er fyldt med en buffer, og pipetten giver mulighed for direkte kontakt med bufferen med den intracellulære diskenhed. Dette resulterer i en bioelektrisk grænseflade, der giver ekstremt høje signal til støj forhold, præcis kontrol over cellulære elektriske aktivitet, og ekstremt høj tidsmæssig opløsning. Selv om denne metode er et ekstremt kraftfuldt værktøj, som for nylig blev nedskaleret til en nano-pipettekonfiguration 7, er det forbundet med flere vigtige tekniske begrænsninger. Cytosolfortyndingseffekten8, samt mekaniske vibrationer, begrænser dens nytte til kortsigtede forhør, og det kræver dyrt specialiseret udstyr og et højt niveau af tekniske færdigheder. Desuden begrænser dens bulkiness antallet af celler, der kan registreres eller stimuleres samtidigt, og på grund af dens invasive, det kan ikke omkonfigureres i hele et eksperiment. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet mikroelektrodearrays, men elektrodernes størrelse begrænser den rumlige opløsning samt intracellulær adgang. Nanoelektrodearrayer gør det muligt for intracellulær optagelse og stimulering , men kræver slibende elektroporation for at få adgang til cytosol9,10. Desuden er alle disse metoder substratbundet og er derfor begrænset til in vitro-cellekulturer eller til eksterne overfladiske celler uden adgang til celler, der er inde i et 3-dimensionelt (3D) væv.
Optogenetik11 er almindeligt anvendt til at løse disse 3D og in vivo begrænsninger. Men optogenetiske metoder er baseret på urolige af lysaktiverede plasmamembranionkanaler, der distribueres ved plasmamembranen, hvilket begrænser 3D-rumlige opløsning12 og intracellulære kapaciteter.
Vi har for nylig vist, at silicium nanowires (SiNWs) kan bruges til at udføre intracellulære bioelektriske forhør med submicron rumlig opløsning med forskellige ikke-excitable celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes13. Desuden brugte vi disse SiNWs til at udføre ex-vivo celle specifik forhør i en 3D hjertevæv, at undersøge, hvordan hjerteceller elektrisk par in vivo14. En stor fordel ved denne metode er dens enkelhed; det kræver ingen genetisk modifikation eller voluminøse instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere foto-responsive SiNWs uden behov for sonikering eller elektroporation15. Desuden vil de spontant undslippe endosomal indkapsling og danne en problemfri integration med cytosol og intracellulære organeller13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, betegnes celle-silicium hybrider, besidder den dynamiske, bløde og alsidige karakter af den oprindelige celle, samt de optoelektriske kapaciteter af SiNWs. Efter hybridisering, cellen-SiNW hybrid kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og anvendes til forskellige anvendelser såsom intracellulære bioelektriske stimulation; undersøgelse af intercellulær bioelektrisk kobling in vitro og for in vivo celle specifik forhør. Som en effektiv stimulering kræver co-lokalisering af høj optisk effekt tætheder og SiNWs, kan man opnå høj rumlig opløsning både i 2D og 3D. I denne protokol beskriver vi i detaljer metoden, samt hvordan resultaterne kan analyseres. Fokus er lagt på den intra- og intercellulære undersøgelse in vitro, men in vivo gennemførelsen af denne metode kan udnyttes direkte til mange andre biologiske scenarier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har vist her en enkel måde at udføre intracellulær elektrisk stimulation af celler. I denne demonstration brugte vi MFs, der blev prehybridized med SiNWs, derefter co-kulturperler med CMs. Generelt har de fleste prolifererende celler tendens til at internalisere SiNWs, som tillader brug af denne metode med mange andre celletyper. Desuden, mens vi demonstrerede den intracellulære stimulation af celler, de samme principper kan bruges til at udføre ekstracellulær stimulation af celler. Dette kan gøres ved at bloke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
