Silikon Nanowires ve Optik Stimülasyon İç-ve Hücrelerarası Elektrik Kaplin İncelemeler için
Summary
Bu protokol, hücre içi optik biyo-modülasyonu için basit ve kolay bir yöntemde silikon nanotellerin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik, çeşitli hücre tiplerine son derece uyarlanabilir ve in vitro ve in vivo uygulamaları için de kullanılabilir.
Abstract
Miyofibroblastlar kendiliğinden silikon nanowires içselleştirebilirsiniz (SiNWs), onları biyoelektronik uygulamalar için cazip bir hedef yapma. Bu hücre-silikon meleznormal hücre davranışı için en az tedirginlik ile kurşunsuz optik modülasyon yetenekleri sunuyoruz. Optik yetenekler SiNWs fototermal ve fotoelektrik özellikleri ile elde edilir. Bu melezler standart doku kültürü teknikleri kullanılarak hasat edilebilir ve daha sonra farklı biyolojik senaryolara uygulanabilir. Burada bu melezlerin kardiyak hücrelerin elektriksel bağlantılarını incelemek ve miyofibroblastların birbirleriyle ya da kardiyomiyositlerle nasıl çiftleştiğiyle karşılaştırılabildiğini gösteriyoruz. Bu işlem, birleştirilmiş lazer hattı ile floresan mikroskop ötesinde özel ekipman olmadan gerçekleştirilebilir. Ayrıca kültürde farklı hücreler arasında ve içinde kalsiyum yayılımı nicelik sağlar özel olarak inşa MATLAB rutin kullanımı gösterilir. Miyofibroblastların kardiyomiyositlere göre daha yavaş elektriksel yanıtı olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, miyofibroblast hücreler arası yayılımı biraz daha yavaş gösterir, onların hücre içi hızları karşılaştırılabilir hızları rağmen, boşluk kavşakveya nanotüpler ile pasif yayılma düşündürmektedir. Bu teknik son derece uyarlanabilir ve kolayca diğer hücresel arenalara uygulanabilir, in vitro yanı sıra in vivo veya ex vivo araştırmalar için.
Introduction
Tüm biyolojik organizmalar hücresel davranışı düzenlemek için iyonlar şeklinde elektrik kullanırlar. Hücre zarları iyonların pasif ve aktif taşınmasına izin veren çeşitli spesifik iyon kanalları içerir. Bu iyonlar, nöronal aktivite ve iskelet ve kardiyak kas kontrilliği gibi heyecanlı hücrelerin işlevlerini yönetir. Ancak, biyoelektrik de olmayan uyarılabilir hücrelerde önemli bir rol oynar, hücre çoğalması gibi birçok hücresel fonksiyonları yöneten1, nöroimmünite2,3,4, ve kök hücre farklılaşması5.
Son yıllarda, biyoelektrik alanında biyoelektronik arayüzler için çok sayıda teknolojinin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur ilgi giderek artan bir düzeyde çekmiştir. Mikroelektrot yaması pipetleri hücre içi kayıt ve stimülasyon altın standart6. Bu metodolojide, bir cam pipet birkaç mikron bir gözenek boyutu ile keskin bir kenar oluşturmak için belirli koşullar altında çekilir. Bu pipet bir tampon ile doldurulur ve pipet hücre içi hacmi ile tampon doğrudan temas sağlar. Bu gürültü oranları, hücresel elektrik aktivitesi üzerinde hassas kontrol ve son derece yüksek zamansal çözünürlük için son derece yüksek sinyal veren bir biyoelektrik arayüzü ile sonuçlanır. Bu metodoloji son derece güçlü bir araç olmasına rağmen, hangi son zamanlarda bir nano-pipet yapılandırmaindirgendi 7, birkaç önemli teknik sınırlamalar ile ilişkilidir. Sitosol seyreltme etkisi8,yanı sıra mekanik titreşimler, kısa vadeli sorgulamalar için yarar sınırlar, ve pahalı özel ekipman ve teknik beceri yüksek düzeyde gerektirir. Ayrıca, hantallığı aynı anda kaydedilebilen veya uyarılabilen hücre sayısını sınırlar ve invazivliği nedeniyle bir deney boyunca yeniden yapılandırılamaz. Bu sınırlamaları aşmak için mikroelektrot dizileri geliştirilmiştir, ancak elektrotların büyüklüğü hücre içi erişimin yanı sıra uzamsal çözünürlüğü de sınırlar. Nanoelektrot dizileri hücre içi kayıt ve stimülasyon sağlar ama sitosol erişmek için aşındırıcı elektroporasyon gerektirir9,10. Buna ek olarak, tüm bu metodolojiler substrat bağlı ve böylece in vitro hücre kültürleri ile sınırlıdır, ya da dış yüzeysel hücreler, bir 3 boyutlu (3D) doku içinde hücrelere erişim ile.
Optogenetik11 yaygın olarak bu 3D ve in vivo sınırlamaları gidermek için kullanılır. Ancak, optogenetik yöntemler, 3D uzamsal çözünürlük12 ve hücre içi yetenekleri sınırlayan, plazma membran Dağıtılan ışık aktive plazma membran iyon kanallarının tedirginlikdayanmaktadır.
Biz son zamanlarda silikon nanowires (SiNWs) farklı non-excitable hücreleri ile submikron mekansal çözünürlük ile hücre içi biyoelektrik sorgulama gerçekleştirmek için kullanılabilir göstermiştir, yani kardiyak miyofibroblastlar ve oligodendrocytes13. Ayrıca, bu SiNWs bir 3D kardiyak doku içinde ex-vivo hücre spesifik sorgulama gerçekleştirmek için kullanılan, nasıl kardiyak hücrelerin elektriksel olarak vivo14çift araştırmak için . Bu metodolojinin en önemli avantajı sadeliğidir; herhangi bir genetik modifikasyon veya hantal enstrümantasyon gerektirmez. Birçok hücre spontan sonication veya elektroporasyon15gerek kalmadan fotoğraf duyarlı SiNWs içselleştirmek olacaktır. Buna ek olarak, onlar kendiliğinden endozomal kapsülleme kaçış ve sitosol ve hücre içi organeller ile sorunsuz bir entegrasyon oluşturacak13,15. Bu hücre-SiNWs kompozitler, hücre-silikon melez olarak adlandırılan, orijinal hücrenin dinamik, yumuşak ve çok yönlü doğası, yanı sıra SiNWs optoelektrik yeteneklerine sahip. Hibridizasyon sonra, hücre-SiNW hibrid standart doku kültürü teknikleri kullanılarak hasat edilebilir ve hücre içi biyoelektrik stimülasyon gibi çeşitli uygulamalar için kullanılır; in vitro hücreler arası biyoelektrik bağlantı eğitimi; ve in vivo cell özel sorgulama için. Etkili bir stimülasyon yüksek optik güç yoğunlukları ve SiNWs birlikte lokalizasyonu gerektirir gibi, bir 2D ve 3D hem de yüksek mekansal çözünürlük elde edebilirsiniz. Bu protokolde metodolojiyi ve sonuçların nasıl analiz edilebildiğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Odak in vitro intra-ve hücreler arası araştırma yerleştirilir, ancak bu metodolojinin in vivo uygulanması doğrudan diğer birçok biyolojik senaryolar için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada hücrelerin hücre içi elektriksel stimülasyonunu gerçekleştirmenin basit bir yolunu gösterdik. Bu gösteride, SiNW’lerle önceden melezleştirilen, daha sonra CM’lerle birlikte kültürlenmiş MF’ler kullandık. Genel olarak, en çoğalan hücreler siNWs içselleştirme eğilimi var, hangi diğer birçok hücre türleri ile bu metodolojinin kullanımına izin verir. Ayrıca, biz hücrelerin hücre içi stimülasyon gösterdi iken, aynı ilkeler hücrelerin ekstrahücresel stimülasyon gerçekleştirmek için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (AFOSR FA9550-18-1-0503) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
