Summary
Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.
Abstract
Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.
Introduction
Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular1, neuroinmunidad2,3,4, y la diferenciación de células madre5.
En las últimas décadas, el campo de la bioelectricidad ha generado un creciente nivel de interés, lo que ha contribuido al desarrollo de numerosas tecnologías para interfaces bioelectrónicas. Las pipetas de parches de microelectrodo son el estándar de oro de la grabación y estimulación intracelular6. En esta metodología, una pipeta de vidrio se tira en condiciones específicas para formar un borde afilado con un tamaño de poro de pocos micras. Esta pipeta se rellena con un tampón y la pipeta permite el contacto directo del tampón con el volumen intracelular. Esto da como resultado una interfaz bioeléctrica que produce relaciones de señal a ruido extremadamente altas, control preciso sobre la actividad eléctrica celular y una resolución temporal extremadamente alta. Aunque esta metodología es una herramienta extremadamente potente, que recientemente se redujo a una configuración de nano-pipeta7,se asocia con varias limitaciones técnicas importantes. El efecto de dilución delcitosol 8,así como las vibraciones mecánicas, limita su utilidad a los interrogatorios a corto plazo, y requiere costosos equipos especializados y un alto nivel de habilidad técnica. Además, su voluminosidad limita el número de células que se pueden registrar o estimular simultáneamente, y debido a su invasividad, no puede ser reconfigurada a lo largo de un experimento. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron matrices de microelectrodos, pero el tamaño de los electrodos limita la resolución espacial, así como el acceso intracelular. Las matrices de nanoelectrodos permiten el registro y la estimulación intracelulares, pero requieren electroporación abrasiva para acceder alcitosol 9,10. Además, todas estas metodologías están unidas al sustrato y, por lo tanto, se limitan a cultivos celulares in vitro, o a células superficiales externas, sin acceso a células que están dentro de un tejido tridimensional (3D).
Optogenetics11 se utiliza ampliamente para abordar estas limitaciones 3D e in vivo. Sin embargo, los métodos optogenéticos se basan en las perturbaciones de los canales iónicos de membrana plasmática activados por la luz que se distribuyen en la membrana plasmática, limitando la resolución espacial 3D12 y las capacidades intracelulares.
Recientemente hemos demostrado que los nanohilos de silicio (SiNW) se pueden utilizar para realizar interrogaciones bioeléctricas intracelulares con resolución espacial submicrónico con diferentes células no excitables, a saber, miofibroblastos cardíacos y oligodendrocitos13. Por otra parte, utilizamos estos SINW para realizar interrogatorios específicos de células ex-vivo dentro de un tejido cardíaco 3D, para investigar cómo las células cardíacas se acoplan eléctricamente in vivo14. Una de las principales ventajas de esta metodología es su simplicidad; no requiere ninguna modificación genética o instrumentación voluminosa. Muchas células internalizarán espontáneamente siNWs foto-sensibles sin necesidad de sonicación o electroporación15. Además, escaparán espontáneamente de la encapsulación endosomal y formarán una integración perfecta con el citosol y los orgánulos intracelulares13,15. Estos compuestos cell-SiNWs, llamados híbridos de silicio celular, poseen la naturaleza dinámica, suave y versátil de la célula original, así como las capacidades optoeléctricas de los SiNW. Después de la hibridación, el híbrido cell-SiNW se puede cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y se utiliza para diversas aplicaciones como la estimulación bioeléctrica intracelular; estudio del acoplamiento bioeléctrico intercelular in vitro; y para el interrogatorio específico de la célula in vivo. Como una estimulación eficaz requiere la co-localización de altas densidades de potencia óptica y SiNWs, se puede lograr una alta resolución espacial tanto en 2D como en 3D. En este protocolo describimos en detalle la metodología, así como cómo se pueden analizar los resultados. El enfoque se centra en la investigación intra e intercelular in vitro, pero la implementación in vivo de esta metodología puede ser utilizada directamente para muchos otros escenarios biológicos.
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Protocol
Para garantizar el cumplimiento de las normas éticas, todos los procedimientos animales relacionados con el aislamiento de cardiomiocitos de corazones de roedores fueron aprobados por primera vez por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (IACUC). Además, todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la orientación de la IACUC de la Universidad de Chicago.
1. Preparación de híbridos cell-SiNWs
- Aísle los cardiomiocitos primarios (CM) utilizando un kit comercial siguiendo las pautas del fabricante.
- Preparar DMEM completo para el aislamiento de células primarias complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina-estreptomicina, y 1% L-glutamina.
- Para aislar el miofibroblasto (MF) de la suspensión MFs-CM, pre-placa las células aisladas en un plato de cultivo de tejido (células aisladas de 2 corazones del paso 1.1. por plato de 100 mm) para 1 h. Como los CM necesitan una fibronectina o una superficie tratada con colágeno para adherirse, solo los MF se unen a la superficie de cultivo de tejidos.
- Aspirar la suspensión de células de CM enriquecidas. Estos CM se pueden utilizar para experimentos de acoplamiento heterocelular como se describe en la sección 3. Enjuague los MFs con DMEM para eliminar los CM restantes de la antena MFs.
- Añadir medio de cultivo fresco a los MF y permitir que proliferen hasta que sean confluentes del 80% (2-4 días). Cambia el medio cada dos días.
- Cuando las células estén listas (80% confluentes), prepare siNWs para el paso de hibridación a continuación (paso 1.7).
NOTA: Para ello se pueden utilizar muchos tipos de SiNW. En este experimento, los SINW que fueron cultivados por deposición de vapor químico (CVD) con una configuración de unión p-i-n de núcleo-shell se utilizaron como se describió anteriormente16. Durante el crecimiento de la ECV, los SiNW se cultivan sobre un sustrato de obleas de silicio, y finalmente se mantienen como chips de silicio cubiertos con SINWs. - Corte un chip de 3 mm x 3 mm de una oblea con siNWs cultivados en CVD utilizando un escriba de diamante. Utilice fórceps afilados para manejar la oblea y minimizar el área de superficie que se toca con los fórceps, ya que esto puede romper los SiNW.
- Esterilice el chip enjuagando con 70% de etanol y permitiendo que el etanol se seque durante 30 minutos bajo la luz UV en una campana de flujo laminar de bioseguridad.
- Transfiera el chip a un tubo de microcentrífuga estéril y enjuague el exceso de etanol utilizando medios de cultivo completos.
- Añadir 1 mL de medios de cultivo y sonicar el chip en el baño de sonicación durante 1-10 min. Los medios deben nublarse a medida que los SINW se liberan en los medios.
NOTA: El tiempo y la potencia de sonicación deben optimizarse para diferentes sonicadores o células diferentes, ya que las duraciones más cortas y las potencias más bajas producirán siNW más largos. - Añadir la suspensión siNWs en 5 ml de medios de cultivo y sembrar en el plato de cultivo de tejido de 100 mm con MF. Permita que los SiNWs internalicen durante 4 h y enjuague el exceso de SiNWs de 5x con medios. Permita que los SINW parcialmente internalizados completen la internalización permitiéndoles sentarse durante otra 1 hora antes de su uso.
NOTA: Diferentes tipos de células pueden necesitar diferentes tiempos de concentración y/o internalización de SiNWs. - Preparar la solución de recubrimiento de colágeno diluyendo la solución de cola de colágeno (3 mg/ml) con ácido acético estéril de 20 mM en una proporción de 1:50. Añadir una solución de recubrimiento de 0,5 ml a un plato inferior de vidrio de 35 mm y dejar reposar durante 1 h en 37 oC. Retire la solución y enjuague el plato con PBS estéril.
- Cosecha los híbridos cell-SiNWs tratando las células con 3 ml de trippsina durante 2 min a 37oC. Añadir 10 ml de medios de cultivo y enjuagar los híbridos vigorosamente pipeteando. Centrifugar las células suavemente a 200 x g durante 5 min para evitar dañar las células con los SINW internalizados. Retire el exceso de medios, suspenda las células con 1 ml de medios y se las semilla en el plato inferior de vidrio tratado con colágeno.
NOTA: Los híbridos pueden ser sembrados solos, para investigar el acoplamiento intracelular o intercelular o con CM para investigar el acoplamiento heterocelular in vitro. - Realizar una verificación final de la internalización de SiNW mediante el etiquetado de citosol de las células (calceína-AM, 4 m) y la membrana (marcador de membrana, 2 m) durante 30 minutos a 37 oC, e imágenes de la célula mediante microscopía confocal. Como los SiNW son altamente reflectantes, se puede utilizar la luz reflejada en lugar de la fluorescencia para visualizarlos.
2. Preparación de células para investigaciones intra e intercelulares
- Preparar la solución de recubrimiento de colágeno como en 1.12
- Para la estimulación eléctrica intracelular, híbridos de cultivo con densidades de siembra bajas. Utilice un hemocitociómetro estándar para contar las células de la sección 1.11. y sembrar 50.000 células en un plato inferior de vidrio de 35 mm en medios de cultivo. Para las investigaciones intercelulares, utilice densidades celulares más altas (500.000 células por plato). Para el acoplamiento intercelular entre CM y MFs, co-cultivo de los híbridos con CM recién aislados.
- Permita que las células se adhieran durante la noche antes de realizar experimentos de estimulación óptica. Para las investigaciones intercelulares, permita 48 h a 37 oC para que las células expresen las uniones de separación intercelular antes de que se lleve a cabo el experimento.
- Preparar la solución de material de colorante sensible al calcio (puede mantenerse en -20 oC) añadiendo 50 ml de DMSO a 50 g de Fluo-4 AM. Preparar la solución de tinción diluyendo 1 ml de tinte en 1 ml de DMEM.
- Aspirar el medio de cultivo de las células y añadir 1 ml de solución de tinción. Permita que el tinte se internalice en las células durante 20-30 min a 37 oC. Aspirar el tinte y enjuagar dos veces con PBS estéril.
- Por último, añadir 1 ml de dmEM media DMEM libre de fenol-rojo precalejado, y permitir que el Fluo-4 intracelular se someta a des-esterificación durante 30 min en 37 oC.
- Transfiera las células al microscopio para la toma de imágenes y la estimulación.
3. Imagen óptica y estimulación
- Precalentar un microincubador humidificado a 37oC y una mezcla de burbujas de aire-CO2 (95:5).
- Utilice un microscopio con una línea láser colimada acoplada a la trayectoria de la luz para obtener imágenes de calcio y estimulación óptica.
NOTA: Un microscopio confocal de escaneo es la opción más sencilla debido a sus capacidades de estimulación de puntos. Sin embargo, este procedimiento se puede realizar utilizando cualquier microscopio de florescencia estándar acoplando un rayo láser colimado en el espacio infinito de la trayectoria de luz utilizando un divisor de haz. Cualquier objetivo del microscopio está diseñado para que un láser colimado pasado a través de él se enfoque a un punto láser limitado de difracción en el plano focal. La longitud de onda del láser debe estar cerca de la luz de excitación, por lo que será reflejada por el espejo dicroico y pasada por el filtro de excitación. - Visualice los SiNW y determine el sitio de estimulación utilizando microscopía de campo brillante, luz transmitida o luz reflectante. A continuación, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del SiNW.
- Validar la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso para cada tamaño y tipo de célula SiNW, para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas. Para un protocolo de estimulación típico, realice un registro basal de 2-10 s de la actividad de calcio intracelular. A continuación, aplique un solo pulso láser de 1-10 mW de potencia y 1-10 ms de duración (correspondiente a 30-300 kW/mm2) para estimular el SiNW, y registre la onda de calcio resultante para otros 2-10 s.
NOTA: Es esencial optimizar la potencia óptica y la longitud del pulso para cada tamaño y células SiNW. Esto es necesario para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas. - Transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica, si es necesario, para su posterior análisis.
4. Procesamiento de vídeo
- Visualice los cambios en la fluorescencia Fluo-4 utilizando la macro "dF sobre F"17 disponible para ImageJ18, que calcula el cambio en los recuentos de fluorescencia para cada píxel y normaliza por el valor medio de la línea base en reposo. Convierta la salida (formato de punto flotante) en 8 bits para su posterior procesamiento.
- Procese la película dF/F más adelante utilizando el filtro de mediana selectiva"Eliminar valores atípicos"disponible en ImageJ. Defina parámetros para eliminar píxeles donde su valor esté más de 10 por encima del valor mediano en un radio de 2 píxeles y reemplace ese valor de píxel por la mediana.
- Calcule el flujo óptico en cada fotograma a través del algoritmo Lucas-Kanade, tal como se implementa en la caja de herramientas Matlab Computer Vision. La salida de esta función era un campo vectorial que contenía los componentes x e y del flujo óptico en cada punto de cada imagen (el código está disponible en el archivo suplementario 1).
NOTA: El flujo óptico medio dentro de una célula, <->, corresponde al desarrollo del flujo de calcio dentro de una célula. El diferencial del flujo óptico, "<">, proporciona el punto de tiempo en el que se activó la señalización de calcio, identificando dónde se maximizó la señal. Además, la magnitud de la onda de calcio en su máximo se correlaciona con la velocidad a la que el frente de onda de calcio progresa a través de la célula. - Calcular la velocidad intercelular de la transmisión de calcio de acuerdo con la siguiente ecuación.
vCa2+ á rij / ( tmax,j á tmax,i ),
donde tmax,j y tmax,i son los tiempos de activación para las celdas j e i, respectivamente, y rij es la distancia entre los centroides de las celdas.
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Representative Results
La capacidad de esta metodología para permitir el acceso directo al citosol intracelular depende de la internalización espontánea del SiNW en las células. Aunque los SINW se someterán a una internalización espontánea en muchos tipos celulares15,algunas células, como los cardiomiocitos y las neuronas, necesitarán que los SINW sean tratados para permitir su internalización19. En este protocolo describimos el proceso de internalización de los SiNW p-i-n con un diámetro de 200-300 nm y de 1-3 m de largo en MF cardíaco. Utilizando la óptica de contraste de fase estándar, las células confluentes eran fácilmente evidentes. Sin embargo, los SiNW eran apenas visibles, haciendo que sus ubicaciones fueran imposibles de definir. Por lo tanto, usamos microscopía de campo oscuro, donde sólo se pueden ver objetos reflectantes y el fondo es oscuro. En este contraste, sin embargo, las células no se pueden ver, ya que no son reflectantes. Para mostrar la ubicación del SiNW en las células, superponemos las imágenes juntas, de modo que la disposición perinuclear de los SiNW dentro de las células es evidente. Aunque la colocación de los SiNWs y las células es evidente, todavía es importante verificar que los SiNW están interiorizados dentro de las células, y no descansan en la membrana plasmática. Para ello, utilizamos microscopía confocal(Figura 1B),donde el citosol se tiñó con calceína-AM (verde) y la membrana plasmática con un marcador de membrana (rojo). La ubicación intracelular de los SINW era entonces evidente. Observe que este paso es extremadamente importante para verificar la ubicación intracelular de los SINW, especialmente cuando se utiliza un nuevo tipo de celda (o línea). Sin embargo, después de establecer la internalización de las células manchadas, se deben utilizar otras muestras para el procedimiento de estimulación. Aunque no está dentro del ámbito de esta demostración, también es importante mencionar que en los casos en que los SINW no están internalizados, los procesos bioeléctricos todavía pueden ser examinados de una manera similar, extracelular16. Después de que las células se hibridan con los SINW, se pueden utilizar para realizar estudios bioeléctricos.
Aquí demostramos el uso de esta metodología para comparar el acoplamiento eléctrico homocelular MF-MF con el acoplamiento heterocelular de MF con los CM. Después de que las células se hibridaron con los SINW, los híbridos fueron sembrados con CM y cultivados. Es importante limitar el tiempo de cultivo para que los MF proliferantes no sobrepoblan la cultura. La Figura 2 muestra un ejemplo representativo de tal experimento. Las células co-cultivadas fueron cargadas con tinte sensible al calcio (Fluo-4) y las células fueron imágenes bajo un microscopio confocal de disco giratorio. Antes de aplicar cualquier pulso láser, se obtuvo una imagen de campo brillante para identificar la ubicación de un SiNW que será estimulado. A continuación, se grabó un breve vídeo de línea de base, por lo que se pueden identificar los CM que golpean espontáneamente y los ML en reposo(Vídeo Suplementario 1 y Vídeo Suplementario 2). En este experimento, el SiNW identificado fue estimulado con un pulso láser de un solo punto (640 nm, 1 ms, 4 mW). Las células fueron constantemente imágenes antes y después de la estimulación para visualizar la dinámica de calcio sobre la estimulación óptica. Como las células en el cultivo difieren mucho en su brillo (Video Suplementario 1), los videos en vivo fueron procesados en videos dF/F con pseudocolor azul a rojo(Vídeo Suplementario 2),para que las señales de calcio sean más claras. En este método, cada píxel se compara con su propio estado de reposo de línea base, antes de aplicar la estimulación. Las imágenes representativas de la Figura 2C demuestran la propagación del calcio dentro del cocultiva MFs-CM y se pueden analizar más a fondo para estudiar el acoplamiento eléctrico intercelular entre las diferentes células, así como la dinámica del calcio intracelular.
La Figura 3A muestra una manera de representar el flujo de calcio de todo el campo de visión en una sola imagen. Analizando los videos dF/F, mostramos el tiempo en el que las diferentes celdas se excitaron, lo que fue determinado por el punto en el que el cambio en el flujo óptico promedio alcanza su máximo. De esta manera, se puede ver cómo el flujo de calcio se propagó de una célula a otra. Se escribió y utilizó un script MATLAB personalizado(Archivo suplementario 1) para calcular el flujo óptico y ayudar a identificar el momento de activación dentro de cada región de celda (Figura 3B). La velocidad de propagación intercelular se puede determinar midiendo la distancia entre los centroides de cada célula y dividiendo por la diferencia de tiempo en su activación. Se puede realizar un análisis similar que sustituya la distancia por el número de cruces de cruces; para nuestros propósitos, la métrica de distancia presenta más fielmente la velocidad de transmisión, ya que también representa el tiempo empleado en la propagación intracelular, que no es despreciable. La Figura 3C muestra cómo se determinaron las velocidades intracelulares: para cada célula, se dibujó una línea en la dirección de propagación de calcio y se generó un cifógrafo trazando el perfil de tiempo de intensidad a lo largo de esa línea. Encajamos una línea en el frente de la onda de activación en el cifógrafo, de modo que la pendiente de la línea representaba la inversa de la velocidad de propagación intracelular. La Figura 3D resume las diferentes velocidades (inter- e intracelulares) para las diferentes células en el co-cultivo. Todos los datos representados en este gráfico se derivaron del único vídeo de un único campo de visión representativo que se presentó aquí.
Figura 1: SiNWs internalizado en MFs. (A) La imagen de contraste de fase de los MF tratados con SINW muestran células confluentes (izquierda). La imagen de Campo Oscuro muestra los SiNW dispersos en el campo de visión (medio), mientras que la superposición de las dos imágenes (derecha) muestra la disposición perinuclear de los SiNW dentro de los MF. Las barras de escala son de 20 m. (B) La imagen confocal representativa (izquierda, la barra de escala es de 10 m) y 3 secciones transversales n-z diferentes que corresponden a las 3 líneas discontinuas (derecha, las barras de escala son de 5 m) muestran la parte interna de un MF y el SiNW que están claramente dentro del citosol. El citosol es verde (Calcein-AM), la membrana roja (máscara celular) y el SiNWs blanco (reflexión). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Propagación de calcio en el co-cultivo MF-CM. (A) Ilustración de un experimento de estimulación típico. Los MF con SINWs internalizados se estimulan con un pulso láser, mientras que el flujo de calcio es monitoreado por un tinte sensible al calcio. (B) Una imagen de campo brillante de las células muestra el SiNW internalizado dentro de uno de los MF (izquierda) y una imagen representativa de fluorescencia del tinte de calcio (derecha). El SiNW estimulado se resalta con una punta de flecha rosa. (C) Se cargó un co-cultivo de MFs y CM con tinte sensible al calcio y se estimuló un SiNW con un pulso láser (640 nm, 1 ms, 4 mW). El flujo de calcio fue monitoreado por la intensidad Fluo-4 (imágenes superiores) y un video dF/F se derivó de él (imágenes inferiores). El algoritmo dF/F hace que la visualización del flujo de calcio sea más clara, ya que compara la intensidad de cada píxel con su propia línea de base, mostrando así el cambio, y no la intensidad real. Las barras de escala son de 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis pf los videos dF/F de la Figura 2. (A) la propagación del calcio se puede visualizar a través de una imagen de mapeo óptico, donde los códigos de color para el tiempo el píxel se excitaba (lo que significa aumento en la concentración de calcio y fluo-4 intensidad relativa). La asignación óptica se puede hacer para diferentes marcos de tiempo, es decir, duraciones cortas (1,1 s, imagen superior) o más largas (5,5 s, imagen inferior). Las barras de escala son de 20 m. (B) Ejemplos representativos para calcular la velocidad de transmisión de células de celda. Ambas células son MFs aquí, pero el mismo cálculo se puede realizar con la transmisión MF-CM. Los gráficos muestran las trazas para el flujo óptico promedio (medio) y el diferencial (abajo) para cada celda. La transmisión de celda-célula se puede calcular utilizando el Tmax para ambas celdas, así como sus centroides, como se describe en el texto. Los asteriscos rojos denotan dos CM con acoplamiento MF-CM limitado y, por lo tanto, falta de respuesta a la estimulación óptica. Las barras de escala son de 20 m. (C) la velocidad del flujo de calcio intracelular de los MF se derivó de la pendiente de un cifógrafo generado por el corte de las líneas de color. Los kymographs representan intensidad a lo largo de la línea (eje x) y tiempo (eje y), de modo que las pendientes más pronunciadas corresponden a velocidades más altas. Las barras de escala son de 20 m. (D) Las velocidades intercelulares MFs-MFs y MFs-CM, así como las velocidades intracelulares de los MF pueden derivarse de B y C respectivamente y trazarse para su comparación (p-value<0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video Suplementario 1: Efecto de la estimulación óptica híbrida MF-SiNW por Fluo-4. La tasa de CM se ilustra antes y después de la estimulación para la comparación. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video Suplementario 2: Efecto de la estimulación óptica híbrida MF-SiNW por el video dF/F, derivado de los videos Fluo-4. La tasa de CM se ilustra antes y después de la estimulación para la comparación. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Figura complementaria Por favor haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la estimulación extracelular de las células. Esto se puede hacer bloqueando las cascadas endosomales15 de las células que las internalizarán espontáneamente, o usando células que no internalizan siNWs. Por ejemplo, aunque se encontró que los CM internalizaban algunas nanoestructuras20,21,no interiorizan espontantemente siNWs15. Los SINW utilizados aquí fueron sintetizados usando un aparato de deposición de vapor químico (CVD). Consulte los recursos adicionales con respecto al procedimiento detallado para la síntesis de SINWs, que se pueden encontrar en otro lugar16. Después de obtener SiNWs, su manejo y uso son simples, y no requieren ningún equipo sofisticado o costoso que no esté disponible en un laboratorio biomédico estándar. Los SiNW se pueden ver fácilmente utilizando la microscopía de campo oscuro estándar (Figura 1), lo que facilita al usuario seguir el proceso de internalización y determinar la concentración y la duración de tratamiento sinW adecuada que es necesaria para una internalización exitosa. También se recomienda encarecidamente determinar la ubicación final exacta de los SINW después de que se complete el paso de internalización. Esto se puede hacer mediante tintes disponibles comercialmente utilizados para ensayos vivos (como Calcein-AM, utilizado aquí) y microscopía confocal (Figura 1B). Este paso es importante cuando se utiliza una línea diferente de celdas por primera vez y la interacción celda-SiNW no está clara. Diferentes células pueden internalizar SiNW en diferentes condiciones, es decir, tiempo, concentración y distribución del tamaño. Sin embargo, después de que el proceso de internalización se caracteriza por una célula determinada, este procedimiento de verificación se puede omitir mientras se realizan estudios bioelécticos mecánicos.
Después de que las células se hibridan con los SINW, pueden ser cosechadas por técnicas estándar de cultivo de tejidos y utilizadas para investigaciones bioeléctricas. En este protocolo, utilizamos híbridos MFs-SiNWs para investigar cómo los MFs se acoplan eléctricamente a otros MFs, o a LOS CM in vitro. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este procedimiento también se puede utilizar para realizar ensayos in vivo. Por ejemplo, en un estudio previo de nuestro laboratorio utilizamos esta metodología para estudiar cómo los MFs se acoplan eléctricamente a los CM in vivo y compararlo con su acoplamiento in vitro14. Como este proceso requiere algunas capacidades técnicas más, no se describe en este protocolo, pero los detalles se pueden encontrar en nuestro estudio anterior. Aquí, mostramos cómo las células híbridas se pueden utilizar para aprender cómo el calcio se propaga intra e intercelularmente dentro del co-cultivo (Figura 2A). Para comenzar el experimento, la ubicación de un SiNW se determina para la estimulación de puntos. Aunque los SiNW apenas son visibles usando contraste de fase, es importante mencionar que el campo brillante estándar (sin contraste de fase o campo oscuro) también permitirá su visualización (Figura 2B), sin necesidad de etiquetado fluorescente o técnicas especializadas de microscopía. Después de identificar un SiNW de interés, se puede aplicar un pulso óptico para estimular eléctricamente la célula. Antes de aplicar la estimulación, el registro basal de las células muestra actividad eléctrica espontánea en cuatro grupos diferentes de CM, que parecen estar sin sincronizar en su actividad eléctrica (Video Suplementario 1 Y Video Suplementario 2). Además, se pueden ver 8 MF diferentes sin actividad eléctrica espontánea. Las imágenes representativas de colorante de calcio y dF/F muestran la propagación del calcio en todo el cultivo tras la estimulación óptica (Figura 2CY Video Suplementario 1 Y Video Suplementario 2). Estos videos en vivo se pueden analizar más a fondo para aprender el acoplamiento eléctrico de las diferentes células en el campo de visión (Figura 3). En primer lugar, la asignación óptica del vídeo (Figura 3A) muestra la secuencia de células estimuladas por el pulso óptico. Las barras de tiempo de la derecha son relativas al primer fotograma después de aplicar la estimulación óptica. Como la respuesta de los CM a la estimulación es mucho más rápida que la de los MF, realizamos el mapeo óptico dos veces, con diferentes marcos de tiempo. El primero se realizó para mostrar la respuesta rápida de los CM, de modo que el rango de color cubre 1.1 s después de la estimulación. Esto muestra el orden en el que los diferentes CM y los primeros MFs se excitan por la estimulación. Sin embargo, puesto que hay MFs que están más abajo el trayecto de propagación, su sincronización de excitación no aparece en esta asignación. Por lo tanto, el mismo análisis se realizó durante una mayor duración, lo que da menos detalles sobre la respuesta inicial, pero demuestra claramente el tiempo de retraso y la respuesta más lenta de los ML que están aguas abajo del sitio de excitación. Usando nuestro algoritmo personalizado, pudimos proporcionar un análisis cuantitativo reproducible de la sincronización máxima del flujo de calcio, que usamos como referencia, junto con la distancia de la célula desde la estimulación, para determinar la velocidad de propagación intercelular a esa célula. Esto se realizó en los CM y en los ML, de modo que se pueda medir la diferencia clara entre la propagación pasiva (MF-MF) y amplificada (MF-CM). Además, se puede demostrar claramente que la actividad eléctrica de dos CM (asteriscos rojos en Figura 3B) no se ven afectados por la estimulación óptica. Esto se puede atribuir al hecho de que no todas las células están igualmente acopladas a otra dentro del cultivo. Esta técnica permite al usuario identificar qué celdas en el campo de visión se acoplan de hecho a la celda estimulada y cuáles no. Además, pudimos determinar la dirección de propagación dentro de cada celda y establecer una línea paralela que se utilizó para derivar un cifógrafo que describe la propagación dentro de esa celda. Esto se utilizó para determinar la velocidad del flujo de calcio intracelular, de acuerdo con la pendiente del cifógrafo (Figura 3C). Cuando se compilaron todas las velocidades intra e intercelulares, estaba claro que la respuesta de los CM era significativamente más rápida que la de la respuesta de los MC a la estimulación óptica. Al mismo tiempo, se encontró que las velocidades intracelulares de los MF eran ligeramente más rápidas, pero comparables a las velocidades de propagación intercelular MF-MF. Esta observación sugiere que a diferencia del acoplamiento eléctrico amplificado entre los MF a los CM, el acoplamiento eléctrico intercelular entre los MF es pasivo, y basado en la difusión de calcio a través del volumen intracelular, y luego de las uniones de brecha intercelulares22,23 o tunelización de nanotubos24, actuando como un cuello de botella que ralentiza la velocidad de propagación. La capacidad de los SINW para transducir la estimulación óptica a un interrogatorio bioeléctrico puede atribuirse a la reacción fotoanodica y fotocatódica en la unión p-n de los SiNW, o a la reacción fototérmica debido a la baja capacidad de calor de los SiNW13. Aunque otras partículas a nanoescala pueden transducir estimulación óptica25, por lo general se encapsulan en un sobre endosomal26, limitando su capacidad de interactuar directamente con los orgánulos intracelulares para el interrogatorio local. Es importante darse cuenta de que la alta densidad óptica de la estimulación puede resultar en daño celular debido al efecto fototérmico. Por lo tanto, es importante optimizar la potencia y la longitud del pulso para evitar tal efecto. Sin embargo, para las células sensibles, es posible estudiar cómo el calcio se propaga entre las otras células en el cultivo, incluso si se aplica daño térmico local a la célula estimulada.
Otro aspecto clave de esta metodología de análisis es que todos los datos mostrados en la Figura 3D se recopilaron de un único vídeo de un único campo de visión dentro de esa referencia cultural. A pesar de utilizar un único campo de visión, los datos recopilados seguían siendo lo suficientemente fuertes como para obtener significación estadística, lo que demuestra la fuerza y eficiencia de esta metodología. Para analizar y estudiar efectos más delicados y sutiles, un conjunto de datos mucho más grande se puede generar fácilmente estimulando otras células dentro del mismo cultivo. Para un plato de fondo de vidrio con un diámetro efectivo de 10 mm, se pueden encontrar más de 2000 campos de visión para analizar. Como es necesario establecer una estimulación láser de punto simple, cada experimento de estimulación debe tardar menos de 1 minuto en realizarse. Esto permitirá que muchos estudios mecánicos se realicen de una manera que son inaccesibles utilizando técnicas tradicionales como la abrazadera de parches, o la matriz de microelectrodas con posiciones de electrodos predefinidas. Además, el tamaño a nanoescala de los SINW utilizados en el presente documento, permite la estimulación con una resolución espacial extremadamente alta. En cuanto a la resolución temporal, se determinará mediante el microscopio utilizado para la imagen/simulación. En este contexto, el uso de imágenes dará lugar a una resolución temporal baja, esto se puede mejorar mediante el uso de técnicas de electrofisiología más sensibles al tiempo, como la abrazadera de parche o matrices de microdestón. Aunque los SINW se consideran bioabsorbibles a largo plazo, nunca hemos notado ninguna degradación notable dentro del plazo de hasta 7 días, lo que permitirá su uso para la mayoría de los estudios in vitro.
En general, utilizamos una técnica simple y directa para realizar una investigación bioeléctrica in vitro de las células cardíacas. Mostramos cómo podemos estudiar de la manera diferente diferentes células se acoplan entre sí y se describe una manera reproducible de cuantificar la propagación y velocidad del calcio. La técnica es adaptable a otros tipos de células, así como a los ajustes in vivo y ex vivo. Se basa en la microscopía de fluorescencia estándar y un láser acoplado que están ampliamente disponibles para los laboratorios biomédicos estándar, y no hay necesidad de equipos especializados. La técnica se puede dominar fácilmente y puede permitir la recopilación de grandes conjuntos de datos en un tiempo mínimo, en comparación con las técnicas disponibles.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
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