Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.
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Artículo de método
Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.
Introducción
Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular1, neuroinmunidad2,3,
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Protocolo
Para garantizar el cumplimiento de las normas éticas, todos los procedimientos animales relacionados con el aislamiento de cardiomiocitos de corazones de roedores fueron aprobados por primera vez por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (IACUC). Además, todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la orientación de la IACUC de la Universidad de Chicago.
1. Preparación de híbridos cell-SiNWs
- Aísle los cardiomiocitos primarios (CM) utilizando un kit comercial siguiendo las pautas del fabricante.
- Preparar DMEM completo para el aislamiento de células primarias....
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Resultados
La capacidad de esta metodología para permitir el acceso directo al citosol intracelular depende de la internalización espontánea del SiNW en las células. Aunque los SINW se someterán a una internalización espontánea en muchos tipos celulares15,algunas células, como los cardiomiocitos y las neuronas, necesitarán que los SINW sean tratados para permitir su internalización19. En este protocolo describimos el proceso de internalización de los SiNW p-i-n con un diámetro de 200-.......
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Discusión
Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la estimulación e.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 35 mm Platos con fondo de vidrio | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Disco Giratorio Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Naranja Membrana plasmática Tinción | Invitrogen | C10045 | |
| Colágeno I, cola de rata | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Rotero de Trazado de Diamantes | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar Falcon | 08-772E | ||
| Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, | Gibco | 10082147 | |
| Proteína Humana de Fibronectina, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Limpiador ultrasónico avanzado | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, permeant celular | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO cámara de control ambiental completa (constante temperatura, humedad y CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios | Thermo Scientific | 88281 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol | Gibco | 25200056 |
Referencias
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain t....
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Reimpresiones y permisos
