Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.
Abstract
Myofibroblasts יכול באופן ספונטני להפנים nanowires סיליקון (SiNWs), מה שהופך אותם יעד אטרקטיבי עבור יישומים ביו-אלקטרוניים. כלאיים אלה של תאים-סיליקון מציעים יכולות אפנון אופטי ללא עופרת עם סטיה מינימלית להתנהגות תאים רגילה. היכולות האופטיות מתקבלות על ידי המאפיינים הפוטותרמיים והפוטואלקטריים של SiNWs. בני כלאיים אלה ניתן לקצור באמצעות טכניקות תרבות רקמות סטנדרטיות ולאחר מכן להחיל על תרחישים ביולוגיים שונים. אנו מדגימים כאן כיצד בני-כלאיים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד את הזיווג החשמלי של תאי לב ולהשוות כיצד myofibroblasts זוג אחד לשני או cardiomyocytes. תהליך זה יכול להתבצע ללא ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ פלורסנט עם קו לייזר בשילוב. כמו כן מוצג השימוש של שגרת MATLAB בהתאמה אישית המאפשרת כימות של הפצת סידן בתוך ובין התאים השונים בתרבות. Myofibroblasts מוצגים יש תגובה חשמלית איטית יותר מזה של cardiomyocytes. יתר על כן, ההתפשטות הבין-תאית myofibroblast מראה מעט איטי יותר, אם כי מהירויות דומות למהירות תאית שלהם, מציע התפשטות פסיבית דרך צמתים פער או צינורות. טכניקה זו היא הסתגלות גבוהה, ניתן להחיל בקלות על זירות סלולריות אחרות, עבור במבחנה, כמו גם בחקירות vivo או לשעבר vivo.
Introduction
כל האורגניזמים הביולוגיים משתמשים בחשמל, בצורה של יונים, כדי לווסת את ההתנהגות התאית. קרום התא מכיל סוגים שונים של ערוצי יונים ספציפיים המאפשרים הובלה פסיבית ופעילה של יונים. יונים אלה שולטים בפונקציות של תאים מרגשים, כגון פעילות עצבית והתכווצות שריר השלד והלבי. עם זאת, ביו-אלקטריות ממלאת תפקיד חשוב גם בתאים שאינם מרגשים, השולטת בפונקציות תאיות רבותכגון התפשטותתאים 1 ,חסינות עצבית 2,3,4,ובידול תאי גזע5.
בעשורים האחרונים, תחום הביו-אלקטריות משך רמה הולכת וגוברת של עניין, אשר תרמה לפיתוח טכנולוגיות רבות עבור ממשקים ביו-אלקטרוניים. פיפטות תיקון Microelectrode הם תקן הזהב של הקלטה תאית וגירוי6. ב מתודולוגיה זו, פיפטה זכוכית נמשך בתנאים ספציפיים כדי ליצור קצה חד עם גודל נקבובית של מיקרון מעט. פיפטה זו מלאה במאגר והפיפטה מאפשרת מגע ישיר של המאגר עם אמצעי האחסון התוך תאי. התוצאה היא ממשק ביו-חשמלי המניב יחסי איתות גבוהים באופן קיצוני לרעש, שליטה מדויקת בפעילות החשמלית הסלולרית ורזולוציית זמן גבוהה באופן קיצוני. למרות מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה מאוד, אשר לאחרונה הוקטן לתצורת ננו-pipette7, הוא משויך מספר מגבלות טכניות חשובות. אפקט דילול ציטוסול8, כמו גם תנודות מכניות, מגביל את השירות שלה לחקירות קצרות טווח, והוא דורש ציוד מיוחד יקר ורמת מיומנות טכנית גבוהה. יתר על כן, bulkiness שלה מגביל את מספר התאים שניתן להקליט או מגורה בו זמנית, ו בשל פולשניותו, זה לא ניתן להגדיר מחדש לאורך כל ניסוי. כדי להתגבר על מגבלות אלה פותחו מערכי מיקרו-אלקטרודה, אך גודל האלקטרודות מגביל את הרזולוציה המרחבית, כמו גם את הגישה התוך תאית. מערכי Nanoelectrode מאפשרים הקלטה וגירוי תאיים, אך דורשים אלקטרואידיות שוחקת כדי לגשת לציטוסול9,10. בנוסף, כל המתודולוגיות הללו מאוגדים בתחום המיצות ולכן מוגבלות לתרביות תאים במבחנה, או לתאים שטחיים חיצוניים, ללא גישה לתאים שבתוך רקמה תלת-ממדית (תלת-ממדית).
Optogenetics11 משמש נרחב כדי לטפל אלה 3D ובמגבלות vivo. עם זאת, שיטות optogenetic מבוססות על הסטיות של ערוצים יון פלזמה המופעלים באור המופצים על קרום פלזמה, הגבלת הרזולוציה המרחבית 3D12 ויכולות תאיות.
לאחרונה הראנו כי nanowires סיליקון (SiNWs) יכול לשמש לביצוע חקירה ביו-אלקטרית תאית עם רזולוציה מרחבית submicron עם תאים שונים שאינם מרגשים, כלים כלשהם מיופיברובלסטים לב ואוליגודנדרוציטים13. יתר על כן, השתמשנו אלה SiNWs לבצע לשעבר vivo תא חקירה ספציפית בתוך רקמת לב 3D, כדי לחקור כיצד תאי לב זוג חשמלי vivo14. יתרון מרכזי של מתודולוגיה זו הוא הפשטות שלה; זה לא דורש כל שינוי גנטי או מכשור מגושם. תאים רבים באופן ספונטני להפנים SiNWs צילום מגיב ללא צורך sonication או אלקטרואידציה15. בנוסף, הם ימלטו באופן ספונטני מהאנקוסום הא אנדו-אומלי ויתגבשו אינטגרציה חלקה עם האיברים התוךתאיים 13,15. אלה cell-SiNWs מרוכבים, בשם תאים-סיליקון היברידיים, בעל אופי דינמי, רך ורב-תכליתי של התא המקורי, כמו גם את היכולות האופטואלקטריות של SiNWs. לאחר הכלאה, ניתן לקצור את התא-SiNW היברידית באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות רקמות ולהשתמש בהן עבור יישומים שונים כגון גירוי ביו-חשמלי תאי; לימוד צימוד ביו-אלקטרי בין-תאי במבחנה; ועל חקירה ספציפית של תא Vivo. מכיוון שגירוי יעיל דורש התאמה אישית של צפיפויות הספק אופטי גבוהות ו-SiNWs, ניתן להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה הן ב-2D והן בתלת-מיד. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה, כמו גם את האופן שבו ניתן לנתח את התוצאות. ההתמקדות מונחת על החקירה הבין-תאית והבין-תאית במבחנה, אך ניתן לנצל את יישום vivo של מתודולוגיה זו באופן ישיר עבור תרחישים ביולוגיים רבים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כדי להבטיח עמידה בסטנדרטים אתיים, כל ההליכים בבעלי חיים הקשורים לבידוד קרדיומיוציטים מלבבות מכרסמים אושרו לראשונה על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו (IACUC). בנוסף, כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מאוניברסיטת שיקגו IACUC.
1. הכנת תאים-SiNWs היברידיות
- בודדו קרדיומיוציטים ראשיים (CMs) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להנחיות היצרן.
- הכן DMEM מלא לבידוד תאים ראשי בתוספת 10% סרום חום לא פעילות של חזיר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין.
- כדי לבודד myofibroblast (MFs) מן המתלה MFs-CMs, מראש צלחת התאים המבודדים על צלחת תרבות רקמות (תאים מבודדים מ 2 לבבות מ שלב 1.1. לכל 100 מ"מ צלחת) עבור 1 שעה. כמו CMs צריך פיברונטין או קולגן מטופל משטח לדבוק, רק MFs יהיה לצרף משטח תרבות רקמות.
- שאף את מתלי תאי ה-CMs המועשרים. CMs אלה יכולים לשמש לניסופי צימוד הטרו-תאיים כמתואר בסעיף 3. יש לשטוף את ה- MFs באמצעות DMEM כדי לסלק את כל המדינות הנותרות מצלחת ה- MFs.
- הוסף מדיום תרבות טריה ל- MFs ואפשר להם להתרבות עד שהם כ-80% מתל-זמניים (2-4 ימים). לשנות את המדיום כל יומיים.
- כאשר התאים מוכנים (80% confluent), להכין SiNWs לשלב הכלאה להלן (שלב 1.7).
הערה: סוגים רבים של SiNWs יכולים לשמש עבור זה. בניסוי זה, SiNWs שגדלו על ידי תצהיר אדים כימיים (CVD) עם תצורת צומת p-i-n מעטפת הליבה שימשו כמתוארקודם לכן 16. במהלך הצמיחה CVD, SiNWs גדלים על קבי וופל סיליקון, ובסופו של דבר נשמרים כמו שבבי סיליקון מכוסים SiNWs. - חותכים שבב של 3 מ"מ x 3 מ"מ מוופל עם SiNWs שגדלו ב-CVD באמצעות סופר יהלומים. השתמש במרטיות חדות כדי לטפל בוופל ולמזער את שטח הפנים שנוגע במרטיות, מכיוון שזה עלול לשבור את ה-SiNWs.
- לחטא את השבב על ידי שטיפה עם 70% אתנול ומאפשר אתנול להתייבש במשך 30 דקות תחת אור UV במכסה זרימה למינאר biosafety.
- מעבירים את השבב לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ושטיפה של אתנול עודף באמצעות מדיה של תרבות שלמה.
- להוסיף 1 מ"ל של מדיה תרבות sonicate השבב באמבט sonication במשך 1-10 דקות. התקשורת צריכה להיות מעונן כמו SiNWs משתחררים לתקשורת.
הערה: זמן Sonication וכוח צריך להיות ממוטב עבור sonicators שונים או תאים שונים, כמו משכים קצרים יותר וכוחות נמוכים יותר יניבים SiNWs ארוך יותר. - הוסף את השעיית SiNWs לתוך 5 מ"ל של מדיה תרבות זרע אותו על 100 מ"מ צלחת תרבות רקמות עם MFs. אפשרו לSiNWs להפנים במשך 4 שעות ולשטוף את SiNWs עודף את 5x עם מדיה. אפשרו ל-SiNWs פנימי חלקית להשלים את ההפניה בכך שתאפשר להם לשבת עוד שעה אחת לפני השימוש.
הערה: סוגי תאים שונים עשויים להזדקק לריכוז ו/או זמני הפניה שונים של SiNWs. - הכן פתרון ציפוי קולגן על-ידי דילול פתרון מלאי קולגן (3 מ"ג/מ"ל) עם חומצה אצטית סטרילית של 20 מ"מ ביחס של 1:50. הוסף תמיסת ציפוי 0.5 מ"ל לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ ולאפשר לו לשבת במשך 1 שעות ב 37 ° C. הסר את התמיסה ושטוף את הצלחת באמצעות PBS סטרילי.
- לקצור את התא-SiNWs היברידיות על ידי טיפול בתאים עם 3 מ"ל של שלושה שלושה פעמים במשך 2 דקות ב 37 ° C. להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות ולשטוף את היברידיות במרץ על ידי pipetting. צנטריפוגה התאים בעדינות ב 200 x g במשך 5 דקות כדי למנוע נזק לתאים עם SiNWs הפנימי. הסר מדיה עודפת, להשעות תאים עם 1 mL מדיה ולזרע אותם על צלחת התחתית זכוכית מטופל קולגן.
הערה: ניתן לזרוע את ההיברידיות לבדן, לחקור צימוד תאי או בין-תאי או עם CMs כדי לחקור צימוד הטרו-תאי במבחנה. - לבצע אימות סופי של ההפניה SiNW על ידי תיוג ציטוסול של תאים (calcein-AM, 4 μM) וממברנה (סמן קרום, 2 μM) במשך 30 דקות ב 37 °C, והדמיה התא באמצעות מיקרוסקופית confocal. כמו SiNWs הם מאוד רפלקטיביים, אור משתקף יכול לשמש במקום פלואורסץ כדי לדמיין אותם.
2. הכנת תאים לחקירות פנים ובין-תאיות
- הכן תמיסת ציפוי קולגן כמו ב- 1.12
- לגירוי חשמלי תאי, תרבות היברידית עם צפיפויות זריעה נמוכות. השתמש בממוציתומטר סטנדרטי כדי לספור תאים מסעיף 1.11. ולזרע 50,000 תאים על צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ במדיה תרבות. לצורך חקירות בין-תאיות, השתמש בצפיפות תאים גבוהה יותר (500,000 תאים לצלחת). לזיווג בין-תאי בין CMs ל-MFs, שתף את בני הכלאיים עם CMs חדשים ומבודדים.
- אפשר לתאים לצרף בן לילה לפני ביצוע ניסויי גירוי אופטי. לצורך חקירות בין-תאיות, אפשרו 48 שעות ב-37°C לתאים לבטא צמתים בין-תאיים לפני ביצוע הניסוי.
- להכין פתרון מלאי צבע רגיש סידן (ניתן לשמור ב -20 °C) על ידי הוספת 50 μL של DMSO כדי 50 μg Fluo-4 AM. להכין פתרון כתמים על ידי דילול 1 μL של צבע ב 1 מ"ל של DMEM.
- לשאוף את מדיום התרבות מתאי ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת כתמים. אפשר לצבע להפנים לתאים למשך 20-30 דקות ב-37°C. לאסוף את הצבע ולשטוף פעמיים עם PBS סטרילי.
- לבסוף, הוסף 1 מ"ל של מדיה DMEM DMEM ללא פנול-אדום חם מראש, ואפשר ל-Fluo-4 התוך תאי לעבור דה-אסתרציה למשך 30 דקות ב-37°C.
- העבר תאים למיקרוסקופ להדמיה וגירוי.
3. הדמיה אופטית וגירוי
- מחממים מראש מיקרו-אינקובטור לח ל-37°C ותערובת אוויר-CO2 של בועות (95:5).
- השתמש במיקרוסקופ עם קו לייזר קולימטו יחד לתוך נתיב האור להדמיית סידן וגירוי אופטי.
הערה: מיקרוסקופ סריקה confocal היא האפשרות הפשוטה ביותר בשל יכולות גירוי הנקודה שלה. עם זאת, הליך זה יכול להיעשות באמצעות כל מיקרוסקופ פלורסנס סטנדרטי על ידי צימוד קרן לייזר collimated לתוך החלל האינסוף של נתיב האור באמצעות מפצל קרן. כל מטרת מיקרוסקופ מתוכננת כך שלייזר קולימט שעבר דרכו יתמקד בנקודת לייזר מוגבלת במפזר במטוס המוקד. אורך גל הלייזר צריך להיות קרוב לאור העירור, כך שהוא ישתקף על ידי המראה הדיקתית ויעבור על ידי מסנן העירור. - הצג באופן חזותי את ה-SiNWs ולקבוע את אתר הגירוי באמצעות מיקרוסקופית brightfield, אור משודר או אור מחזיר אור. לאחר מכן, הגדר מחדש את נתיב האור למצב פלואורסץ, תוך שמירה על נקודת הגירוי במיקום המוגדר מראש של ה- SiNW.
- אמת את כוח הגירוי האופטימלי ואת אורך הדופק עבור כל גודל SiNW וסוג תא, כדי למזער נזק פוטותרמי לתאים מגורה. עבור פרוטוקול גירוי טיפוסי, בצע הקלטה בסיסית של 2-10 של פעילות הסידן התוך תאי. לאחר מכן, להחיל פעימת לייזר יחיד של 1-10 mW כוח ו 1-10 ms משך (המקביל 30-300 kW / מ"מ2)כדי לעורר את SiNW, ולתואם את גל הסידן שנוצר עבור עוד 2-10 s.
הערה: חיוני לייעל את הכוח האופטי ואת אורך הדופק עבור כל גודל ותאים SiNW. זה הכרחי כדי למזער את הנזק פוטותרמי לתאים מגורה. - העבר את הסרטים שהוקלטו של הגירוי האופטי, במידת הצורך, לניתוח נוסף.
4. עיבוד וידאו
- הצג באופן חזותי שינויים בפלואורסץ Fluo-4 באמצעות המאקרו "dF over F"17 הזמין עבור ImageJ18, המחשב את השינוי בספירת הפלואורסץ עבור כל פיקסל, ומנרמל לפי הערך הממוצע של תוכנית הבסיס למנוחה. המר את הפלט (תבנית נקודה צפה) ל- 8 סיביות לעיבוד נוסף.
- לעבד את הסרט dF / F עוד יותר באמצעות "הסרת חריגים" מסנן חציון סלקטיבי זמין ImageJ. הגדר פרמטרים להסרת פיקסלים שבהם הערך שלהם גבוה מ- 10 מעל הערך החציוני ברדיוס של 2 פיקסלים והחלף ערך פיקסל זה בחציון.
- חשב את הזרימה האופטית בכל מסגרת באמצעות אלגוריתם לוקאס-קנדה, כפי שמיושם ב- Matlab Computer Vision. הפלט של פונקציה זו היה שדה וקטור המכיל את רכיבי ה- x וה- y של הזרימה האופטית בכל נקודה בכל תמונה (קוד זמין בקובץ משלים 1).
הערה: הזרימה האופטית ממוצעת בתוך תא, <ν>, תואמת להתפתחות שטף סידן בתוך תא. ההיפרטה של הזרימה האופטית, מספקת את נקודת הזמן שבה הופעל איתות הסידן, על-ידי זיהוי היכן הוגדל האות. בנוסף, סדר הגודל של ןוה - חשב את המהירות הבין-תאית של שידור סידן בהתאם למשוואה הבאה.
vCa2+ = rij / ( tmax, j - t max, i ),
איפה מקס, ג'יי ותקס מקס, אני זמני ההפעלה של התאים J ואני, בהתאמה, וrIJ הוא המרחק בין centroids של התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת של מתודולוגיה זו לאפשר גישה ישירה ציטוסול תאי תלוי ההפנימה הספונטנית של SiNW לתאים. למרות SiNWs יעבור ההפניה ספונטנית לסוגי תאיםרבים 15, תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes ונוירונים, יצטרכו את SiNWs כדי לאפשר ההפנימהשלהם 19. בפרוטוקול זה אנו מתארים את תהליך ההפניה של p-i-n SiNWs עם 200-300 ננ"מ קוטר ו ~ 1-3 μm ארוך לתוך MFs לב. איור 1A מדגים איך SiNWs הופיעו תחת מיקרוסקופ אור משודר. באמצעות אופטיקה סטנדרטית של ניגודיות שלב, התאים התווך היו ברורים בקלות. עם זאת, ה-SiNWs בקושי נראו, מה שהופך את מיקומם לבלתי אפשרי להגדרה. לכן, השתמשנו במיקרוסקופ שדה כהה, שבו ניתן לראות רק אובייקטים משקפים והרקע כהה. בניגוד זה, עם זאת, לא ניתן לראות את התאים, כפי שהם אינם משקפים. כדי להראות את המיקום של SiNW בתאים, אנחנו העלינו את התמונות יחד, כך הסידור perinuclear של SiNWs בתוך התאים ניכר. למרות colocalization של SiNWs ותאים ניכר, עדיין חשוב לוודא כי SiNWs אכן פנימי בתוך התאים, ולא נח על קרום הפלזמה. לשם כך, השתמשנו במיקרוסקופ confocal(איור 1B),שבו ציטוסול היה מוכתם calcein-AM (ירוק) ואת קרום פלזמה עם סמן קרום (אדום). המיקום התוך תאי של ה-SiNWs היה אז ברור. שים לב כי שלב זה חשוב מאוד כדי לאמת את המיקום התוך תאי של ה- SiNWs, במיוחד כאשר נעשה שימוש בסוג תא חדש (או קו). עם זאת, לאחר ההפניה נוצרת עבור התאים המוכתמים, דגימות אחרות יש להשתמש עבור הליך הגירוי. למרות שלא מדובר בהיקף של הפגנה זו, חשוב גם לציין כי במקרים בהם ה-SiNWs אינם מופנים, תהליכים ביו-אלקטריים עדיין עשויים להיבדק בדרך דומה וחוץ-תאית16. לאחר התאים הם היברידיים עם SiNWs, הם יכולים לשמש לביצוע מחקרים ביואלקטריים.
כאן אנו מדגימים את השימוש במתודולוגיה זו כדי להשוות את צימוד חשמלי MF-MF הומו-תאי לצימוד הטרו-תאי של MFs ל-CMs. לאחר התאים היו היברידיים עם SiNWs, היברידיות היו זרעים עם CMs ותרבותי. חשוב להגביל את זמן התרבות כך MFs המתפשט לא לאכלס יתר על המידה את התרבות. איור 2 מציג דוגמה מייצגת לניסוי כזה. תאים בעלי תרבות הדדית היו טעונים בצבע רגיש לסידן (Fluo-4) והתאים תופפו תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי של דיסק מסתובב. לפני החלת כל פולס לייזר, תמונת brightfield הושגה כדי לזהות את המיקום של SiNW כי יהיה מגורה. לאחר מכן, הוקלט סרטון בסיסי קצר, כך שניתן לזהות את ה-CMs המכות באופן ספונטני ואת ה-MFs המנוחה(וידאו משלים 1 ווידאו משלים 2). בניסוי זה, SiNW המזוהה היה מגורה עם פולס לייזר נקודה אחת (640 ננ"מ, 1 ms, 4 mW). התאים היו כל הזמן בתמונה לפני ואחרי הגירוי כדי לדמיין את דינמיקת הסידן על גירוי אופטי. כמו תאים בתרבות שונים מאוד בבהירות שלהם(וידאו משלים 1), קטעי וידאו חיים עובדו לתוךdF / F קטעי וידאו עם כחול אדום פסאודוקולור(וידאו משלים 2), כךאותות סידן יהיה ברור יותר. בשיטה זו, כל פיקסל מושווה למצב מנוחה בסיסי משלו, לפני החלת הגירוי. התמונות המייצגות באיור 2C מדגימות את הפצת הסידן בתוך התרבות ההפוכה של MFs-CMs וניתן לנתח אותן עוד יותר כדי לחקור את הזיווג החשמלי הבין-תאי בין התאים השונים, כמו גם את דינמיקת הסידן התוך תאית.
איור 3א מדגים דרך לייצג את שטף הסידן של שדה התצוגה כולו בתמונה אחת. על ידי ניתוח סרטוני dF/F, אנו מראים את הזמן שבו התאים השונים התרגשו, אשר נקבע על ידי הנקודה שבה השינוי בזרימה האופטית הממוצעת מגיע למקסימום שלו. בדרך זו, ניתן לראות כיצד שטף הסידן מופגם מתא לתא. קובץ MATLAB מותאם אישית(קובץ משלים 1) נכתב ונעשה בו שימוש לחישוב הזרימה האופטית ולסייע בזיהוי זמן ההפעלה בתוך כל אזור תא(איור 3B). לאחר מכן ניתן לקבוע את מהירות ההפצה הבין-תאית על-ידי מדידת המרחק בין הצנטרואידים של כל תא וחלוקה לפי הפרש הזמן בהפעלה שלהם. ניתן לבצע ניתוח דומה המחליף את המרחק במספר מעברי הצומת; למטרותינו, מדד המרחק בנאמנות רבה יותר מציג את מהירות השידור כפי שהוא גם מסביר את הזמן בילה בהפצה תוך תאית, אשר אינו זניח. איור 3C מדגים כיצד נקבעו המהירויות התוך תאיות: עבור כל תא, קו צויר בכיוון של הפצת סידן וקימוגרף נוצר על ידי התוויית פרופיל זמן העוצמה לאורך קו זה. אנו מתאימים קו לחזית גל ההפעלה בקימוגרף, כך שמדרונות הקו ייצגו את ההופכי של מהירות ההפצה התוך-תאית. איור תלת-מית' מסכם את המהירויות השונות (בין-תאיות ואינטר-תאיות) עבור התאים השונים בתרבות ההתפלה. כל הנתונים המיוצגים בגרף זה נגזרו מוידאו יחיד של שדה תצוגה מייצג יחיד שהוצג כאן.
איור 1: SiNWs מופנים לתוך MFs. (א)תמונת ניגודיות שלב של חברי פרלמנט שטופלו ב- SiNWs מציגה תאים בו-זמניים (משמאל). תמונת Darkfield מציגה את ה-SiNWs המפוזרים בשדה התצוגה (באמצע), תוך העלמה של שתי התמונות (מימין) מציגה את הסידור הנוקב של ה-SiNWs בתוך חברי הכנסת. סרגלי קנה מידה הם 20 μm. (ב)תמונה confocal נציג (שמאל, סרגל קנה מידה הוא 10 μm) ו 3 חתך רוחב n-z שונים התואמים 3 קווים מקווקווים (ימין, סרגלי קנה מידה הם 5 μm) להראות את החלק הפנימי של MF ו SiNW כי הם בבירור בתוך cytosol. הציטוסול ירוק (Calcein-AM), קרום אדום (מסכת תא), ולבן SiNWs (השתקפות). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הפצת סידן בתרבות שיתוף MF-CM. (א)איור של ניסוי גירוי טיפוסי. MFs עם SiNWs פנימי מגורה עם פולס לייזר, בעוד שטף הסידן מנוטר על ידי צבע רגיש סידן. (ב)תמונת שדה בהירה של התאים מציגה את ה- SiNW הפנימי בתוך אחד ממוסיפי ם (משמאל) ותדמית פלואורסצנטית מייצגת של צבע הסידן (מימין). SiNW מגורה מודגש על ידי ראש חץ ורוד. (ג)תרבות שותף של MFs ו-CMs היה טעון בצבע רגיש סידן וSiNW היה מגורה עם פולס לייזר (640 ננ"מ, 1 ms, 4 mW). זרימת הסידן הייתה במעקב על ידי עוצמת Fluo-4 (תמונות העליון) וידאו dF / F נגזר ממנו (תמונות למטה). אלגוריתם dF/F הופך את ההדמיה של שטף הסידן לבהירה יותר, כאשר הוא משווה את עוצמת כל פיקסל לקו הבסיס שלו, ובכך מציג את השינוי, ולא את העוצמה בפועל. סולם ברים הוא 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח סרטוני dF/F מאיור 2. (א)ניתן לדמיין את הפצת הסידן באמצעות תמונת מיפוי אופטי, שבה קודי הצבע לזמן הפיקסל היה נרגש (כלומר עלייה בריכוז הסידן ועוצמה יחסית Fluo-4). ניתן לעשות את המיפוי האופטי עבור מסגרות זמן שונות, כלומר קצרים (1.1 שניות, תמונה למעלה) או משכי זמן ארוכים יותר (5.5 שניות, תמונה למטה). קווי קנה מידה הם 20 μm. (B) דוגמאות מייצגות לחישוב מהירות שידור תא. שני התאים הם MFs כאן, אבל אותו חישוב יכול להתבצע עם שידור MF-CM. הגרפים מציגים את העקבות עבור הזרימה האופטית הממוצעת (באמצע) וההי דיפרנציאל (למטה) עבור כל תא. לאחר מכן ניתן לחשב את שידור התא באמצעות ה-Tmax עבור שני התאים, כמו גם עבור הסנטרואידים שלהם, כמתואר בטקסט. כוכביות אדומות מציינות שני CMs עם צימוד MF-CM מוגבל ולכן חוסר תגובה לגירוי אופטי. פסי קנה מידה הם 20 μm.(ג)מהירות שטף הסידן תאי של MFs נגזר השיפוע של kymograph שנוצר על ידי חיתוך הקווים הצבעוניים. הקימוגרפים מייצגים עוצמה לאורך הקו (ציר x) וזמן (ציר y), כך שמדרונות תלולים יותר מתאימים למהויות גבוהות יותר. קווי קנה מידה הם 20 μm.(D)MFs-MFs ו MFs-CMs מהוות בין תאיות, כמו גם מהוות פנים תאיות של MFs ניתן לגזור B ו-C בהתאמה ומתווים להשוואה (p-value<0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו משלים 1: ההשפעה של MF-SiNW גירוי אופטי היברידי על ידי Fluo-4. שיעור ה-CMs מאויר לפני ואחרי הגירוי להשוואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
וידאו משלים 2: ההשפעה של MF-SiNW גירוי אופטי היברידי על ידי וידאו dF / F, נגזר פלו-4 קטעי וידאו. שיעור ה-CMs מאויר לפני ואחרי הגירוי להשוואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
איור משלים אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הראינו כאן דרך פשוטה לבצע גירוי חשמלי תאי של תאים. בהדגמה זו, השתמשנו ב-MFs שהיו מותאמים מראש עם SiNWs, ואז שיתוף פעולה עם CMs. באופן כללי, רוב התאים המתרבים יש נטייה להפנים SiNWs, המאפשר את השימוש מתודולוגיה זו עם סוגי תאים רבים אחרים. יתר על כן, בעוד הראינו את הגירוי תאי של תאים, אותם עקרונות יכולים לשמש לביצוע גירוי חוץ תאי של תאים. זה יכול להיעשות על ידי חסימת מפליםאנדו-גושיים 15 של תאים כי באופן ספונטני להפנים אותם, או באמצעות תאים שלא להפנים SiNWs. לדוגמה, למרות CMs נמצאו להפנים כמה nanostructures20,21, הם לא להפנים באופן ספונטני SiNWs15. SiNWs בשימוש כאן היו מסונתזים באמצעות אדים כימיים תצהיר (CVD) צג. עיין במשאבים נוספים בנוגע להליך המפורט לסינתזה של SiNWs, שניתן למצוא במקום אחר16. לאחר קבלת SiNWs, הטיפול והשימוש בהם פשוטים, אינם דורשים ציוד מתוחכם או יקר שלא זמין במעבדה ביו-רפואית סטנדרטית. ניתן לראות בקלות את ה-SiNWs באמצעות מיקרוסקופית Darkfield סטנדרטית (איור 1), מה שמקל על המשתמש לעקוב אחר תהליך ההפניה ולקבוע את משך הריכוז והטיפול המתאימים של SINW הדרוש להפנימה מוצלחת. מומלץ גם לקבוע את המיקום הסופי המדויק של SiNWs לאחר השלמת שלב ההפניה. ניתן לעשות זאת על ידי צבעים זמינים מסחרית המשמשים לחי-מתים (כגון Calcein-AM, בשימוש כאן) ומיקרוסקופ confocal(איור 1B). שלב זה חשוב כאשר נעשה שימוש בקו תאים שונה בפעם הראשונה, והאינטראקציה עם התא-SiNW אינה ברורה. תאים שונים עשויים להפנים SiNW בתנאים שונים כלומר זמן, ריכוז, וחלוקת גודל. עם זאת, לאחר תהליך ההפניה מאופיין עבור תא נתון, ניתן לדלג על הליך אימות זה בעת ביצוע מחקרים ביו-חשמליים מכניים.
לאחר התאים הם היברידיים עם SiNWs, הם יכולים להיקצר על ידי טכניקות סטנדרטיות של תרבות רקמות ולהשתמש בהם לחקירות ביו-חשמליות. בפרוטוקול זה, השתמשנו בהיברידיות של MFs-SiNWs כדי לחקור כיצד חברי פרלמנט מזוגים חשמלית ל-MFs אחרים, או ל-CMs במבחנה. עם זאת, חשוב לציין כי הליך זה יכול לשמש לביצוע ב- vivo assays גם כן. למשל, במחקר קודם מהמעבדה שלנו השתמשנו בשיטה זו כדי ללמוד כיצד חברי פרלמנט מזוגים חשמלית ל-CMs ב-vivo ולהשוות את זה לזיווג שלהם במבחנה14. כמו תהליך זה דורש כמה יכולות טכניות יותר, זה לא מתואר בפרוטוקול זה, אבל את הפרטים ניתן למצוא במחקר הקודם שלנו. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בתאים ההיברידיים כדי ללמוד כיצד סידן מצטלם תוך-ובין-תאי בתוך התרבות ההתופתית (איור 2א). כדי להתחיל בניסוי, המיקום של SiNW נקבע לגירוי נקודה. למרות SiNWs הם בקושי גלויים באמצעות ניגודיות שלב, חשוב להזכיר כי brightfield סטנדרטי (ללא ניגודיות שלב או darkfield) יאפשר גם החזותיים שלהם (איור 2B), ללא כל צורך בתיוג פלורסנט או בטכניקות מיקרוסקופיות מיוחדות. לאחר זיהוי SiNW של עניין, אחד יכול להחיל פעימה אופטית כדי לעורר חשמלית את התא. לפני החלת הגירוי, הקלטה בסיסית של התאים מראה פעילות חשמלית ספונטנית בארבע קבוצות שונות של CMs, אשר נראה לא מנומק בפעילות החשמלית שלהם (וידאו משלים 1 ו- וידאו משלים 2). יתר על כן, 8 MFs שונים ללא פעילות חשמלית ספונטנית ניתן לראות. צבע סידן מייצג ותמונות DF/F מציגות את הפצת הסידן בכל רחבי התרבות על גירוי אופטי (איור 2Cו, וידאו משלים 1 ו- וידאו משלים 2). ניתן לנתח את הסרטונים החיים הללו כדי ללמוד את הזיווג החשמלי של התאים השונים בתחום התצוגה (איור 3). ראשית, מיפוי אופטי של הווידאו (איור 3א) מציג את רצף התאים המגורה על ידי הדופק האופטי. פסי הזמן מימין הם יחסיים למסגרת הראשונה לאחר החלת הגירוי האופטי. מכיוון שתגובת ה-CMs לגירוי מהירה בהרבה מזה של חברי ם, ביצענו את המיפוי האופטי פעמיים, עם מסגרות זמן שונות. הראשון בוצע כדי להציג את התגובה המהירה של CMs, כך טווח הצבעים מכסה 1.1 s לאחר הגירוי. זה מראה את הסדר שבו CMs שונים ו MFs הראשון מתרגשים על ידי הגירוי. עם זאת, מאחר שיש MFs כי הם במורד הזרם יותר את נתיב ההפצה, תזמון העירור שלהם אינו מופיע במיפוי זה. לפיכך, אותו ניתוח בוצע למשך זמן ארוך יותר, אשר נותנים פחות פרטים על התגובה הראשונית, אך מדגים בבירור את זמן ההשהיה ואת התגובה האיטית יותר של MFs שנמצאים במורד הזרם מאתר העירייה. באמצעות האלגוריתם המותאם אישית שלנו, הצלחנו לספק ניתוח כמותי רב-נפחי של תזמון שטף הסידן המקסימלי, שבו השתמשנו כהפניה, יחד עם המרחק של התא מהגירוי, כדי לקבוע את מהירות ההפצה הבין-תאית לתא זה. פעולה זו בוצעה הן על ה-CMs והן על ה- MFs, כך שניתן למדוד את ההבדל הברור בין ההתפשטות הפסיבית (MF-MF) לבין התפשטות מוגבר (MF-CM). יתר על כן, ניתן להראות בבירור כי הפעילות החשמלית של שני CMs (כוכביות אדומות ב איור 3B) אינם מושפעים מהגירוי האופטי. ניתן לייחס זאת לעובדה שלא כל התאים מזוגים באופן שווה לאחר בתוך התרבות. טכניקה זו מאפשרת למשתמש לזהות אילו תאים בשדה התצוגה אכן מזוגים לתא המגורה, ואיזה לא. בנוסף, הצלחנו לקבוע את כיוון ההפצה בתוך כל תא ולהגדיר קו מקביל ששימש להוועת קימוגרף המתאר את ההתפשטות בתוך תא זה. זה שימש כדי לקבוע את מהירות שטף הסידן התוך תאי, על פי השיפוע של kymograph (איור 3C). כאשר כל המהירויות התוך-תאיות והבין-תאיות נאספו, היה ברור שתגובת ה-CMs הייתה מהירה משמעותית מהתגובה של חברי ם לגירוי האופטי. במקביל, מהירויות תאיות של MFs נמצאו מעט מהר יותר, אבל דומה למהירויות ההפצה הבין-תאית MF-MF. תצפית זו מצביעה על כך שבניגוד לזיווג החשמלי מוגבר בין MFs ל-CMs, הזיווג החשמלי הבין-תאי בין חברי תק הוא פסיבי ומבוסס על דיפוזיה של סידן דרך נפח תאי, ולאחר מכן צמתים בין-תאיים22,23 או צינורות מנהרה24מתנהג כמו צוואר בקבוק שמאט את מהירות ההתפשטות., ניתן לייחס את היכולת של ה-SiNWs להעביר את הגירוי האופטי לחקירה ביו-אלקטרית לתגובה הפוטואנודית והפוטו-קוטודית בצומת P-N של ה-SiNWs, או לתגובה הפוטותרמית בשל קיבולת החום הנמוכה של ה-SiNWs13. למרות שחלקיקים אחרים בקנה מידה ננו יכולים תמרש גירוי אופטי25הם בדרך כלל עוטפת לתוך מעטפה אנדו-תפלה,26הגבלת יכולתם להתממשק ישירות עם אורגנלים תאיים לחקירה מקומית., חשוב להבין כי הצפיפות האופטית הגבוהה של הגירוי עלולה לגרום לנזק תאי בשל אפקט פוטותרמי. לכן, חשוב לייעל את הכוח ואת אורך הדופק כך השפעה כזו תימנע. עם זאת, עבור תאים רגישים, ניתן ללמוד כיצד הסידן מתפוצץ בין התאים האחרים בתרבות, גם אם נזק תרמי מקומי מוחל על התא מגורה.
היבט מרכזי נוסף של מתודולוגיית ניתוח זו הוא שכל הנתונים המוצגים באיור תלת-מירבי נאספו מתוך סרטון יחיד של שדה תצוגה יחיד בתוך תרבות זו. למרות השימוש בשדה תצוגה יחיד, הנתונים שנאספו עדיין היו חזקים מספיק כדי לקבל משמעות סטטיסטית, המדגימה את העוצמה והיעילות של מתודולוגיה זו. כדי לנתח וללמוד אפקטים עדינים ועדינים יותר, ניתן ליצור בקלות סט נתונים גדול בהרבה על ידי גירוי תאים אחרים באותה תרבות. עבור צלחת תחתית זכוכית עם קוטר יעיל של 10 מ"מ, אחד יכול למצוא יותר מ 2000 שדות תצוגה לנתח. כמו גירוי לייזר נקודה פשוטה צריך להיות מוגדר, כל ניסוי גירוי צריך לקחת פחות מ 1 דקות כדי לבצע. זה יאפשר מחקרים מכניים רבים להתבצע באופן כי הם נגישים באמצעות טכניקות מסורתיות כגון טלאי-מהדק, או מערך microelectrode עם עמדות אלקטרודה מוגדרות מראש. יתר על כן, גודל בקנה מידה ננו של SiNWs בשימוש בכאן, מאפשר גירוי עם רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד. באשר לרזולוציית הזמן, היא תיקבע על ידי המיקרוסקופ המשמש להדמיה/הדמיה. בהקשר זה, באמצעות הדמיה תגרום לרזולוציה זמנית נמוכה, ניתן לשפר זאת באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות רגישות יותר לזמן, כגון מהדק תיקון או מערכי מיקרו-אלקטרודות. למרות SiNWs נחשבים bioabsorbable בטווח הארוך, מעולם לא שמנו לב כל השפלה מורגש בתוך מסגרת הזמן של עד 7 ימים, אשר יאפשר את השימוש בו עבור רוב מחקרי המבחנה.
בסך הכל, השתמשנו בטכניקה פשוטה וישר קדימה כדי לבצע חקירה ביו-חשמלית במבחנה של תאי לב. אנו מראים כיצד אנו יכולים ללמוד את הדרך השונה בה תאים שונים משויבצים זה לזה ותיארו דרך לשחזור לכמת את הפצת הסידן והמהירות. הטכניקה ניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, כמו גם בהגדרות vivo ואקס vivo. הוא מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסץ סטנדרטי ולייזר מזוג הזמינים באופן נרחב למעבדות ביו-רפואיות סטנדרטיות, ואין צורך בציוד מיוחד. ניתן לשלוט בטכניקה בקלות ולאפשר איסוף של ערכות נתונים גדולות בזמן מינימלי, בהשוואה לטכניקות זמינות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר המדעי של חיל האוויר (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
