Silisium nanoledninger og optisk stimulering for undersøkelser av intra- og intercellulær elektrisk kobling

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av silisium nanowires for intracellulær optisk bio-modulasjon av celle i en enkel og enkel å utføre metode. Teknikken er svært tilpasningsdyktig til ulike celletyper og kan brukes til in vitro samt in vivo applikasjoner.

Abstract

Myofibroblaster kan spontant internalisere silisium nanowires (SiNWs), noe som gjør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikasjoner. Disse celle-silisium hybrider tilbyr blyfri optisk modulasjon evner med minimal perturbasjon til normal celle atferd. De optiske egenskapene oppnås av de fototermiske og fotoelektriske egenskapene til SiNWs. Disse hybridene kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og deretter brukes på ulike biologiske scenarier. Vi demonstrerer her hvordan disse hybridene kan brukes til å studere elektrisk kobling av hjerteceller og sammenligne hvordan myofibroblaster par til hverandre eller til kardiomyocytter. Denne prosessen kan oppnås uten spesialutstyr utover et fluorescerende mikroskop med koplet laserlinje. Også vist er bruken av en spesialbygd MATLAB rutine som tillater kvantifisering av kalsium forplantning i og mellom de forskjellige cellene i kulturen. Myofibroblaster er vist å ha en langsommere elektrisk respons enn kardiomyocytter. Videre viser myofibroblast intercellulær forplantning litt langsommere, selv om sammenlignbare hastigheter til deres intracellulære hastigheter, noe som tyder på passiv forplantning gjennom gapkryss eller nanorør. Denne teknikken er svært tilpasningsdyktig og kan enkelt brukes på andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøkelser.

Introduction

Alle biologiske organismer bruker elektrisitet, i form av ioner, for å regulere cellulær oppførsel. Cellemembraner inneholder ulike typer spesifikke iionkanaler som tillater passiv og aktiv transport av ioner. Disse ionene styrer funksjonene til spennende celler, som nevronal aktivitet og skjelett- og hjertemuskelkontraktilitet. Bioelektrisitet spiller imidlertid også en viktig rolle i ikke-spennende celler, som styrer mange cellulære funksjoner som cellespredning^1,nevroimmunitet^2,3,4og stamcelledilatering⁵.

I de siste tiårene har bioelektrisitetsfeltet trukket et økende interessenivå, noe som har bidratt til utviklingen av en rekke teknologier for bioelektroniske grensesnitt. Mikroelektrod patch pipetter er gullstandarden for intracellulær opptak og stimulering⁶. I denne metodikken trekkes en glasspipette under spesifikke forhold for å danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikrometer. Denne pipetten er fylt med en buffer og pipetten tillater direkte kontakt med bufferen med det intracellulære volumet. Dette resulterer i et bioelektrisk grensesnitt som gir ekstremt høye signal-til-støyforhold, presis kontroll over mobilnettets elektriske aktivitet og ekstremt høy temporal oppløsning. Selv om denne metoden er et ekstremt kraftig verktøy, som nylig ble nedskalert til en nanopipettekonfigurasjon^7,er den forbundet med flere viktige tekniske begrensninger. Cytosol fortynning effekt⁸, samt mekaniske vibrasjoner, begrenser verktøyet til kortsiktige avhør, og det krever dyrt spesialisert utstyr og et høyt nivå av tekniske ferdigheter. Videre begrenser dens bulkiness antall celler som kan registreres eller stimuleres samtidig, og på grunn av invasiviteten kan den ikke konfigureres på nytt gjennom et eksperiment. For å overvinne disse begrensningene ble mikroelektrodarrayer utviklet, men størrelsen på elektrodene begrenser romlig oppløsning samt intracellulær tilgang. Nanoelektrodarrayer tillater intracellulær opptak og stimulering, men krever slipende elektroporasjon for å få tilgang til cytosol^9,10. I tillegg er alle disse metodene substrat bundet og er dermed begrenset til in vitro cellekulturer, eller til eksterne overfladiske celler, uten tilgang til celler som er inne i et 3-dimensjonalt (3D) vev.

Optogenetics¹¹ er mye brukt til å løse disse 3D og in vivo begrensninger. Imidlertid er optogenetiske metoder basert på perturbasjonene av lysaktiverte plasmamembranionkanaler som distribueres ved plasmamembranen, og begrenser 3D-romlig^{oppløsning 12} og intracellulære evner.

Vi har nylig vist at silisium nanowires (SiNWs) kan brukes til å utføre intracellulær bioelektrisk avhør med submicron romlig oppløsning med forskjellige ikke-spennende celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes¹³. Videre brukte vi disse SiNWs til å utføre ex-vivo cellespesifikt avhør i et 3D-hjertevev, for å undersøke hvordan hjerteceller elektrisk par i vivo¹⁴. En stor fordel med denne metodikken er dens enkelhet; det krever ingen genetisk modifikasjon eller klumpete instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere fotoresponsive SiNWs uten behov for sonikering eller elektroporasjon¹⁵. I tillegg vil de spontant unnslippe den enoforale innkapslingen og danne en sømløs integrasjon med cytosol og intracellulære organeller^13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, be begrepcelle-silisium hybrider, har den dynamiske, myke og allsidige natur den opprinnelige cellen, samt optoelektriske evner av SiNWs. Etter hybridisering, celle-SiNW hybrid kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og brukes for ulike applikasjoner som intracellulær bioelektrisk stimulering; studere intercellulær bioelektrisk kobling in vitro; og for in vivo cellespesifikke avhør. Som en effektiv stimulering krever sam-lokalisering av høy optisk effekt tettheter og SiNWs, kan man oppnå høy romlig oppløsning både i 2D og 3D. I denne protokollen beskriver vi i detalj metodikken, samt hvordan resultatene kan analyseres. Fokuset er plassert på intra- og intercellulær undersøkelse in vitro, men in vivo implementeringen av denne metodikken kan brukes direkte for mange andre biologiske scenarier.

Protocol

For å sikre overholdelse av etiske standarder ble alle dyreprosedyrer knyttet til å isolere kardiomyocytter fra gnagerhjerter først godkjent av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I tillegg ble alle dyreforsøk utført i fullstendig samsvar med veiledning fra University of Chicago IACUC. 1. Utarbeidelse av celle-SiNWs hybrider Isoler primære kardiomyocytter (CMs) ved hjelp av et kommersielt sett etter produsentens retningslinjer. Forbe…

Representative Results

Denne metodikkens evne til å gi direkte tilgang til intracellulær cytosol avhenger av den spontane internaliseringen av SiNW i cellene. Selv om SiNWs vil gjennomgå spontan internalisering i mange celletyper15,vil noen celler, som kardiomyocytter og nevroner, trenge SiNWs som skal behandles for å tillate deres internalisering19. I denne protokollen beskriver vi internaliseringsprosessen av p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter og ~ 1-3 μm lang inn i hjerte MFs. <strong cl…

Discussion

Vi har vist her en enkel måte å utføre intracellulær elektrisk stimulering av celler. I denne demonstrasjonen brukte vi MFs som var prehybridized med SiNWs, deretter co-kultivert med CMs. Generelt har de fleste voksende celler tendensen til å internalisere SiNWs, noe som gjør det mulig å bruke denne metodikken med mange andre celletyper. Videre, mens vi demonstrerte intracellulær stimulering av celler, kan de samme prinsippene brukes til å utføre ekstracellulær stimulering av celler. Dette kan gjøres ved å b…

Materials

35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056