अंतर और इंटरसेलुलर इलेक्ट्रिकल कपलिंग की जांच के लिए सिलिकॉन नैनोवायर्स और ऑप्टिकल उत्तेजना
Summary
यह प्रोटोकॉल एक सरल और आसान तरीका प्रदर्शन करने के लिए सेल के इंट्रासेलुलर ऑप्टिकल जैव-मॉड्यूलेशन के लिए सिलिकॉन नैनोवायर्स के उपयोग का वर्णन करता है। तकनीक विविध सेल प्रकारों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है और इन विट्रो के साथ-साथ वीवो अनुप्रयोगों में भी उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
Myofibroblasts अनायास सिलिकॉन नैनोवायर्स (एसआईएनडब्ल्यू) को आंतरिक बना सकते हैं, जिससे उन्हें बायोइलेक्ट्रॉनिक अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक लक्ष्य मिल सकता है। ये सेल-सिलिकॉन हाइब्रिड सामान्य सेल व्यवहार के लिए न्यूनतम क्षोभ के साथ लीडलेस ऑप्टिकल मॉड्यूलेशन क्षमताएं प्रदान करते हैं। ऑप्टिकल क्षमताओं को एसआईएनडब्ल्यू के फोटोथर्मल और फोटोइलेक्ट्रिक गुणों द्वारा प्राप्त किया जाता है। इन संकरों को मानक ऊतक संस्कृति तकनीकों का उपयोग करके काटा जा सकता है और फिर विभिन्न जैविक परिदृश्यों पर लागू किया जा सकता है। हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि इन संकरों का उपयोग हृदय कोशिकाओं के विद्युत युग्मन का अध्ययन करने और तुलना करने के लिए कैसे किया जा सकता है कि कैसे myofibroblasts एक दूसरे को या कार्डियोमायोसाइट्स के लिए। इस प्रक्रिया को युग्मित लेजर लाइन के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से परे विशेष उपकरणों के बिना पूरा किया जा सकता है। यह भी दिखाया गया है कि एक कस्टम निर्मित MATLAB दिनचर्या का उपयोग करें जो संस्कृति में विभिन्न कोशिकाओं के भीतर और बीच कैल्शियम प्रचार के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। Myofibroblasts कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना में एक धीमी बिजली की प्रतिक्रिया के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, माइोफिब्रोब्लास्ट इंटरसेलुलर प्रचार थोड़ा धीमा दिखाता है, हालांकि उनके इंट्रासेलुलर वेग के लिए तुलनीय वेग, गैप जंक्शनों या नैनोट्यूब के माध्यम से निष्क्रिय प्रचार का सुझाव देता है। यह तकनीक अत्यधिक अनुकूलनीय है और इन विट्रो के साथ-साथ वीवो या पूर्व वीवो जांच में आसानी से अन्य सेलुलर एरेनास पर लागू की जा सकती है।
Introduction
सेलुलर व्यवहार को विनियमित करने के लिए सभी जैविक जीव आयनों के रूप में बिजली का उपयोग करते हैं। सेल झिल्ली में विभिन्न प्रकार के विशिष्ट आयन चैनल होते हैं जो आयनों के निष्क्रिय और सक्रिय परिवहन की अनुमति देते हैं। ये आयन उत्तेजनीय कोशिकाओं के कार्यों को नियंत्रित करते हैं, जैसे न्यूरोनल गतिविधि और कंकाल और हृदय की मांसपेशी संकुचन। हालांकि, जैव-विद्युतता गैर-उत्तेजनीय कोशिकाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जो कोशिका प्रसार1,न्यूरोआईआईयुनिटी2,3,4और स्टेम सेल भेदभाव5जैसे कई सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करती है।
हाल के दशकों में, जैव विद्युतता के क्षेत्र ने ब्याज का एक बढ़ता हुआ स्तर तैयार किया है, जिसने बायोइलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस के लिए कई प्रौद्योगिकियों के विकास में योगदान दिया है। माइक्रोइलेक्ट्रोड पैच पिपेट इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग और उत्तेजना6का स्वर्ण मानक है। इस पद्धति में, कुछ माइक्रोन के पोर आकार के साथ एक तेज धार बनाने के लिए विशिष्ट परिस्थितियों में एक ग्लास पिपेट खींचा जाता है। यह पिपेट एक बफर से भरा हुआ है और पिपेट इंट्रासेलुलर वॉल्यूम के साथ बफर के सीधे संपर्क की अनुमति देता है। इसके परिणामस्वरूप एक बायोइलेक्ट्रिक इंटरफ़ेस होता है जो शोर अनुपात, सेलुलर विद्युत गतिविधि पर सटीक नियंत्रण और अत्यंत उच्च लौकिक संकल्प के लिए बेहद उच्च संकेत देता है। यद्यपि यह पद्धति एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण है, जिसे हाल ही में नैनो-पिपेट कॉन्फ़िगरेशन7में डाउनस्केल किया गया था, यह कई महत्वपूर्ण तकनीकी सीमाओं से जुड़ा हुआ है। साइटोसोल कमजोर पड़ने प्रभाव8,साथ ही यांत्रिक कंपन, अल्पकालिक पूछताछ के लिए इसकी उपयोगिता को सीमित करता है, और इसके लिए महंगे विशेष उपकरण और उच्च स्तर के तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इसकी बुल्लनेस उन कोशिकाओं की संख्या को सीमित करती है जिन्हें एक साथ रिकॉर्ड या उत्तेजित किया जा सकता है, और इसकी आक्रामकता के कारण, इसे पूरे प्रयोग में पुन: कॉन्फ़िगर नहीं किया जा सकता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी विकसित की गई थी, लेकिन इलेक्ट्रोड का आकार स्थानिक संकल्प के साथ-साथ इंट्रासेलर एक्सेस को सीमित करता है। नैनोइलेक्ट्रोड सरणी इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग और उत्तेजना की अनुमति देती है लेकिन साइटोसोल9,10तक पहुंचने के लिए घर्षण इलेक्ट्रोपाउरेशन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ये सभी पद्धतियां सब्सट्रेट बाउंड हैं और इस प्रकार इन विट्रो सेल संस्कृतियों, या बाहरी सतही कोशिकाओं तक सीमित हैं, जिनमें 3-आयामी (3 डी) ऊतक के अंदर कोशिकाओं तक पहुंच नहीं है।
ऑप्टोजेनेटिक्स11 का व्यापक रूप से इन 3 डी और वीवो सीमाओं को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक विधियां प्रकाश-सक्रिय प्लाज्मा झिल्ली आयन चैनलों के क्षोभ पर आधारित हैं जो प्लाज्मा झिल्ली पर वितरित की जाती हैं, जो 3 डी स्थानिक संकल्प12 और इंट्रासेलुलर क्षमताओं को सीमित करती हैं।
हमने हाल ही में दिखाया है कि सिलिकॉन नैनोवायर्स (एसआईएनडब्ल्यू) का उपयोग विभिन्न गैर-उत्तेजनीय कोशिकाओं, अर्थात् कार्डियक माइफिब्रोब्लास्ट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स13के साथ सबमाइस्रोन स्थानिक संकल्प के साथ इंट्रासेलर बायोइलेक्ट्रिक पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हम इन SiNWs का इस्तेमाल किया एक 3 डी हृदय ऊतक के भीतर पूर्व वीवो सेल विशिष्ट पूछताछ प्रदर्शन करने के लिए, जांच करने के लिए कैसे हृदय कोशिकाओं विद्युत वीवो14में जोड़े । इस पद्धति का एक प्रमुख लाभ इसकी सादगी है; इसके लिए किसी आनुवंशिक संशोधन या भारी इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं होती है। कई कोशिकाएं अनायास फोटो-उत्तरदायी एसआईएनडब्ल्यू को आंतरिक रूप से आंतरिक करेंगी, जिसमें सोनीशन या इलेक्ट्रोपॉशन15की कोई आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, वे अनायास एंडोसोमल एनकैप्सुलेशन से बच जाएंगे और साइटोसोल और इंट्रासेलुलर ऑर्गेनेल्स13, 15के साथ एक निर्बाध एकीकरणबनाएंगे। इन सेल-एसआईएनडब्ल्यूएस कंपोजिट, को सेल-सिलिकॉन हाइब्रिड कहा जाता है, मूल कोशिका की गतिशील, नरम और बहुमुखी प्रकृति के साथ-साथ एसआईएनडब्ल्यू की ऑप्टोइलेक्ट्रिक क्षमताओं के अधिकारी हैं। संकरण के बाद, सेल-एसआईएनडब्ल्यू हाइब्रिड को मानक ऊतक संस्कृति तकनीकों का उपयोग करके काटा जा सकता है और इंट्रासेलुलर बायोइलेक्ट्रिक उत्तेजना जैसे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है; विट्रो में इंटरसेलुलर बायोइलेक्ट्रिक कपलिंग का अध्ययन; और वीवो सेल विशिष्ट पूछताछ के लिए। एक प्रभावी उत्तेजना के रूप में उच्च ऑप्टिकल पावर घनत्व और एसआईएनडब्ल्यू के सह-स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है, इसलिए कोई भी 2डी और 3 डी दोनों में उच्च स्थानिक संकल्प प्राप्त कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में हम कार्यप्रणाली का विस्तार से वर्णन करते हैं, साथ ही परिणामों का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। विट्रो में इंट्रा-और इंटरसेलुलर जांच पर ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन इस पद्धति के वीवो कार्यान्वयन में कई अन्य जैविक परिदृश्यों के लिए सीधे उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने यहां कोशिकाओं की इंट्रासेलुलर विद्युत उत्तेजना करने का एक सरल तरीका प्रदर्शित किया है। इस प्रदर्शन में, हमने एमएफएस का उपयोग किया जो एसआईएनडब्ल्यू के साथ पूर्वनिर्मित थे, फिर सीएम के साथ सह-संस्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वायु सेना के वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यालय (AFOSR FA9550-18-1-0503) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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