Detectie van genetische varianten in het CALR-gen met behulp van smeltanalyse met hoge resolutie
Summary
Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een gevoelige en snelle oplossing voor detectie van genetische varianten. Het hangt af van sequentieverschillen die ertoe leiden dat heteroduplexen de vorm van de smeltcurve veranderen. Door hrm en agarose gel elektroforese te kammen, kunnen verschillende soorten genetische varianten zoals indels worden geïdentificeerd.
Abstract
Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een krachtige methode voor genotypering en genetische variatiescanning. De meeste HRM-toepassingen zijn afhankelijk van verzadigde DNA-kleurstoffen die sequentieverschillen detecteren en heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Uitstekende instrumentresolutie en speciale data-analysesoftware zijn nodig om de kleine smeltcurveverschillen te identificeren die een variant of genotype identificeren. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor patiënten met een specifieke ziekte, met name kanker en in het CALR-gen bij patiënten met Philadelphia-chromosoomnegatieve myeloproliferatieve neoplasmata. Enkelvoudige nucleotideveranderingen, inserties en/of deleties (indels) in het betreffende gen kunnen worden gedetecteerd door de HRM-analyse. De identificatie van verschillende soorten genetische varianten is meestal gebaseerd op de controles die worden gebruikt in de qPCR HRM-test. Naarmate de productlengte toeneemt, wordt het verschil tussen wildtype- en heterozygote curven echter kleiner en is het type genetische variant moeilijker te bepalen. Daarom, waar indels de heersende genetische variant zijn die wordt verwacht in het gen van belang, kan een aanvullende methode zoals agarose gel elektroforese worden gebruikt voor de verduidelijking van het HRM-resultaat. In sommige gevallen moet een niet-overtuigend resultaat opnieuw worden gecontroleerd / opnieuw worden gediagnosticeerd door standaard Sanger-sequencing. In deze retrospectieve studie pasten we de methode toe op JAK2 V617F-negatieve patiënten met MPN.
Introduction
Somatische genetische varianten in het calreticuline-gen(CALR)werden in 2013 herkend bij patiënten met myeloproliferatieve neoplasmata (MPN) zoals essentiële trombocytemie en primaire myelofibrose1,2. Sindsdien zijn meer dan 50 genetische varianten in het CALR-gen ontdekt, die een +1 (−1+2) frameshift3induceren. De twee meest voorkomende CALR genetische varianten zijn een 52 bp deletie (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), ook wel type 1 mutatie genoemd, en een 5 bp insertie (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), ook wel type 2 mutatie genoemd. Deze twee genetische varianten vertegenwoordigen 80% van alle CALR genetische varianten. De andere zijn geclassificeerd als type 1-achtig of type 2-achtig met behulp van algoritmen op basis van het behoud van een α helix dicht bij wild type CALR4. Hier presenteren we een van de zeer gevoelige en snelle methoden voor CALR genetische variantdetectie, de hoge resolutie smeltanalysemethode (HRM). Deze methode maakt de snelle detectie van type 1 en type 2 genetische varianten mogelijk, die de meerderheid van de CALR-mutaties vertegenwoordigen5. HRM werd in 1997 geïntroduceerd in combinatie met real time »polymerasekettingreactie« (qPCR) als hulpmiddel om de mutatie in factor V Leiden6te detecteren. In vergelijking met Sanger sequencing die de gouden standaard techniek vertegenwoordigt, is HRM een meer gevoelige en minder specifieke methode5. De HRM-methode is een goede screeningsmethode die een snelle analyse van een groot aantal monsters mogelijk maakt met een grote kosten-batenverhouding5. Het is een eenvoudige PCR-methode die wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van een fluorescerende kleurstof en vereist geen specifieke vaardigheden. Een ander voordeel is dat de procedure zelf het geanalyseerde monster niet beschadigt of vernietigt, waardoor we het monster opnieuw kunnen gebruiken voor elektroforese of Sanger-sequencing na de HRM-procedure7. Het enige nadeel is dat het soms moeilijk is om de resultaten te interpreteren. Bovendien detecteert HRM de exacte mutatie niet bij patiënten met niet-type 1- of type 2-mutaties8. Bij deze patiënten moet Sanger-sequencing worden uitgevoerd(figuur 1).
HRM is gebaseerd op de amplificatie van het specifieke DNA-gebied in aanwezigheid van verzadigende DNA-fluorescerende kleurstof, die is opgenomen in dubbelstrengs DNA (dsDNA). De fluorescerende kleurstof straalt licht uit wanneer deze in het dsDNA wordt opgenomen. Na een progressieve temperatuurstijging breekt dsDNA af in enkelstrengs DNA, dat op de smeltcurve kan worden gedetecteerd als een plotselinge afname van de fluorescentie-intensiteit. De vorm van de smeltcurve is afhankelijk van de DNA-sequentie die wordt gebruikt om de mutatie te detecteren. Smeltcurven van monsters worden vergeleken met smeltcurven van bekende mutaties of wildtype CALR. Verschillende smeltcurven vertegenwoordigen een andere mutatie die niet type 1 of type 29is.
Het algoritme voor de detectie van somatische genetische varianten in het CALR-gen door HRM, agarosegel-elektroforese en sequencingmethode (figuur 1) werd gebruikt en gevalideerd in de retrospectieve studie gepubliceerd vóór10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoge resolutie smelten van DNA is een eenvoudige oplossing voor genotypering en genetische variant scanning14. Het hangt af van sequentieverschillen die resulteren in heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor een bepaalde groep patiënten met kanker1,2,15,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag alle academische experts en medewerkers van het gespecialiseerde hematologielaboratorium, afdeling hematologie, afdeling interne geneeskunde, universitair medisch centrum Ljubljana bedanken.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
