Detecção de variantes genéticas no gene CALR usando análise de fusão de alta resolução
Summary
A análise de fusão de alta resolução (HRM) é uma solução sensível e rápida para detecção de variantes genéticas. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes mudando a forma da curva de fusão. Ao pentear o HRM e a agarose gel eletroforesis, diferentes tipos de variantes genéticas, como indels, podem ser identificados.
Abstract
A análise de derretimento de alta resolução (HRM) é um método poderoso para genotipagem e varredura de variações genéticas. A maioria das aplicações de HRM dependem de corantes de DNA saturados que detectam diferenças de sequência, e heterodúplexos que mudam a forma da curva de fusão. Excelente resolução de instrumentos e software especial de análise de dados são necessários para identificar as pequenas diferenças de curva de fusão que identificam uma variante ou genótipo. Diferentes tipos de variantes genéticas com diversas frequências podem ser observadas no gene específico para pacientes com uma doença específica, especialmente câncer e no gene CALR em pacientes com neoplasias mieloproliferativas nômodas negativas da Filadélfia. Alterações de nucleotídeos únicos, inserções e/ou exclusões (indels) no gene de interesse podem ser detectadas pela análise do HRM. A identificação de diferentes tipos de variantes genéticas baseia-se principalmente nos controles utilizados no ensaio qPCR HRM. No entanto, à medida que o comprimento do produto aumenta, a diferença entre curvas de tipo selvagem e heterozigoto torna-se menor, e o tipo de variante genética é mais difícil de determinar. Portanto, quando os indels são a variante genética predominante esperada no gene de interesse, um método adicional como a eletroforese de gel de agarose pode ser usado para o esclarecimento do resultado do HRM. Em alguns casos, um resultado inconclusivo deve ser re-verificado/re-diagnosticado pelo sequenciamento Sanger padrão. Neste estudo retrospectivo, aplicamos o método a pacientes JAK2 V617F negativos com MPN.
Introduction
As variantes genéticas somáticas do gene da calreticulina (CALR)foram reconhecidas em 2013 em pacientes com neoplasias mieloproliferativas (MPN), como trombocythemia essencial e mielófibrose primária1,2. Desde então, mais de 50 variantes genéticas no gene CALR foram descobertas, induzindo um quadro de 3 +1 (−1+2). As duas variantes genéticas CALR mais frequentes são uma exclusão de 52 bps (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), também chamada de mutação tipo 1, e uma inserção de 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), também chamada de mutação tipo 2. Essas duas variantes genéticas representam 80% de todas as variantes genéticas CALR. Os outros foram classificados como tipo 1- like ou tipo 2 – como usando algoritmos baseados na preservação de uma hélice α perto do tipo selvagem CALR4. Aqui, apresentamos um dos métodos altamente sensíveis e rápidos para detecção de variantes genéticas CALR, o método de análise de fusão de alta resolução (HRM). Este método permite a detecção rápida de variantes genéticas tipo 1 e tipo 2, que representam a maioria das mutações CALR 5. O HRM foi introduzido em combinação com a reação em cadeia de polimerase em tempo real« (qPCR) em 1997 como uma ferramenta para detectar a mutação no fator V Leiden6. Em comparação com o sequenciamento Sanger que representa a técnica padrão dourada, o HRM é um método mais sensível e menos específico5. O método HRM é um bom método de triagem que permite uma análise rápida de um grande número de amostras com um ótimo custo-benefício5. É um método PCR simples realizado na presença de um corante fluorescente e não requer habilidades específicas. Outro benefício é que o procedimento em si não danifica ou destrói a amostra analisada que nos permite reutilizar a amostra para eletroforese ou sequenciamento de Sanger após o procedimento de HRM7. A única desvantagem é que às vezes é difícil interpretar os resultados. Além disso, o HRM não detecta a mutação exata em pacientes com mutações não tipo 1 ou tipo 28. Nesses pacientes, deve-se realizar o sequenciamento Sanger(Figura 1).
O HRM baseia-se na amplificação da região específica do DNA na presença de corante fluorescente de DNA saturado, que é incorporado em DNA de dupla cadeia (dsDNA). O corante fluorescente emite luz quando incorporado no dsDNA. Após um aumento progressivo da temperatura, o DSNA se divide em um único DNA encalhado, que pode ser detectado na curva de fusão como uma diminuição repentina da intensidade da fluorescência. A forma da curva de fusão depende da sequência de DNA que é usada para detectar a mutação. Curvas de fusão de amostras são comparadas com curvas de fusão de mutações conhecidas ou tipo selvagem CALR. Curvas de fusão distintas representam uma mutação diferente que não é tipo 1 ou tipo29.
O algoritmo para a detecção de variantes genéticas somáticas no gene CALR por HRM, o método de eletroforese e sequenciamento do gel agarose(Figura 1)foi utilizado e validado no estudo retrospectivo publicado antes do10.
Protocol
Representative Results
Discussion
O derretimento de alta resolução do DNA é uma solução simples para genotipagem e escaneamento de variantesgenéticas 14. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes que mudam a forma da curva de fusão. Diferentes tipos de variantes genéticas com frequências diversas podem ser observadas no gene específico para um determinado grupo de pacientes com câncer1,2,15,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a todos os especialistas acadêmicos e colaboradores do Laboratório Especializado de Hematologia, Departamento de Hematologia, Divisão de Medicina Interna do Centro Médico Universitário Ljubljana.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
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