高分解能融解解析を用いた CALR 遺伝子の遺伝的変異体検出
Summary
高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝的変異体検出のための敏感で迅速なソリューションです。それは、ヘテロ二重鎖が融解曲線の形状を変化させる結果となるシーケンスの違いに依存する。HRMとアガロースゲル電気泳動を組み合わせて、インデルなどの異なる種類の遺伝的変異体を同定することができる。
Abstract
高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝子型入力や遺伝子変異スキャンのための強力な方法です。ほとんどのHRMアプリケーションは、配列の違いを検出する飽和DNA色素と、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖に依存しています。優れた装置分解能および特殊なデータ解析ソフトウェアは、変異体または遺伝子型を識別する小さな融解曲線の違いを識別するために必要とされます。さまざまな頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、特定の疾患を有する患者、特に癌、およびフィラデルフィア染色体-陰性骨髄増殖性新生物の患者における CALR 遺伝子に特異的な遺伝子で観察することができる。関心のある遺伝子における単一ヌクレオチドの変化、挿入および/または欠失(インデル)は、HRM分析によって検出され得る。異なる種類の遺伝的変異体の同定は、主にqPCR HRMアッセイで使用されるコントロールに基づいています。しかし、製品の長さが長くなるにつれて、野生型とヘテロ接合曲線の差が小さくなり、遺伝的変異体の種類を特定することがより困難になります。したがって、インデルが目的の遺伝子に期待される一般的な遺伝的変異体である場合、アガロースゲル電気泳動などの追加の方法をHRM結果の解明に使用することができる。場合によっては、決定的な結果を、標準のサンガーシーケンシングによって再チェック/再診断する必要があります。本回顧研究では、MPNを有する JAK2 V617F陰性患者にこの方法を適用した。
Introduction
カレチクリン遺伝子の体細胞遺伝学的変異体(CALR)は、2013年に骨髄増殖性新生物(MPN)の患者(必須血小板血症および原発性骨髄線維症1,2)で認識された。それ以来、CALR遺伝子の50以上の遺伝的変異体が発見され、+1(−1+2)フレームシフト3を誘導している。2つの最も頻繁なCALR遺伝的変異体は、タイプ1突然変異とも呼ばれる52bp欠失(NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52 p.(leu367Thrfs*46))、および5bp挿入(NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC、p.(Lys385Asnfs*47))、タイプ2突然変異とも呼ばれる。これら2つの遺伝的変異体は、全CALR遺伝的変異体の80%を表す。他のものは、野生型CALR4に近いαらせんの保存に基づくアルゴリズムを使用して、タイプ1-likeまたはタイプ2に分類されています。ここでは、CALR遺伝子変異体検出のための高感度かつ迅速な方法の1つ、高分解能融解解析法(HRM)を紹介する。この方法は、CALR突然変異5の大部分を表す1型および2型遺伝的変異体の迅速な検出を可能にする。HRMは、因子Vライデン6の変異を検出するためのツールとして1997年にリアルタイム»ポリメラーゼ連鎖反応«(qPCR)と組み合わせて導入されました。黄金の標準技術を表すサンガーシーケンシングと比較して、HRMはより敏感で、より特異的でない方法5です。HRM法は、多くのサンプルを迅速に分析し、費用便益5を実現する優れたスクリーニング方法である。蛍光色素の存在下で行う簡単なPCR法であり、特定のスキルを必要としません。もう一つの利点は、手順自体がHRM手順7の後に電気泳動またはサンガーシーケンシングのためにサンプルを再利用することを可能にする分析されたサンプルを損傷または破壊しないことである。唯一の欠点は、結果を解釈することが困難な場合もあるということです。さらに、HRMは、非タイプ1またはタイプ2突然変異8を有する患者において正確な突然変異を検出しない。これらの患者では、サンガーシーケンシングを行う必要があります(図1)。
HRMは、飽和DNA蛍光色素の存在下で特異的DNA領域の増幅に基づいており、これは二本鎖DNA(dsDNA)に組み込まれる。蛍光色素は、dsDNAに組み込まれると発光します。徐々に温度が上昇した後、dsDNAは一本鎖DNAに分解し、蛍光強度の急激な低下として融解曲線上で検出することができる。融解曲線の形状は、変異を検出するために使用されるDNA配列に依存する。試料の融解曲線は既知の突然変異または野生型CALRの融解曲線と比較される。明確な融解曲線は、タイプ 1 またはタイプ 29以外の異なる突然変異を表します。
HRMによる CALR 遺伝子における体細胞遺伝学的変異体検出のためのアルゴリズムとしては、アガロースゲル電気泳動およびシーケンシング法(図1)が使用され、10以前に発表された遡及研究で検証された。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNAの高解像度融解は、遺伝子型入力および遺伝的変異体走査14のための簡単なソリューションである。それは、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖をもたらすシーケンスの違いに依存する。多様な頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、癌1、2、15、16、10の特定のグループに特異的な遺伝子で観?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、大学医療センターリュブリャナの内科、血液学部門、専門血液学研究所の学術専門家と従業員全員に感謝したいと考えています。
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
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