JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Agrobacterium-medieretgenetisk transformation, transgene produktion, og dens anvendelse til undersøgelse af mandlige reproduktive udvikling i ris

Published: October 06, 2020
doi:
10.3791/61665
, , , ,
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology,Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy,Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine,University of Adelaide

Summary

Dette arbejde beskriver brugen af CRISPR-Cas9 genom redigering teknologi til knockout endogene gen OsABCG15 efterfulgt af en modificeret Agrobacterium-medierettransformation protokol til at producere en stabil mand-steril linje i ris.

Abstract

Mandlig sterilitet er et vigtigt agronomisk træk for hybrid frøproduktion, der normalt er karakteriseret ved funktionelle defekter i mandlige kønsorganer / gameter. De seneste fremskridt inden for CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi giver mulighed for høj redigeringseffekt og tidsbesparende knockout-mutationer af endogene kandidatgener på bestemte steder. Derudover er Agrobacterium-medieretgenetisk transformation af ris også en vigtig metode til genændring, som er blevet bredt vedtaget af mange offentlige og private laboratorier. I denne undersøgelse anvendte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsværktøjer og genererede med succes tre sterile hanegenterlinjer ved målrettet genomredigering af OsABCG15 i en japonicasortiment. Vi brugte en modificeret Agrobacterium-medieretris transformation metode, der kunne give fremragende midler til genetisk emasculation for hybrid frøproduktion i ris. Transgene planter kan fås inden for 2-3 måneder og homozygot transformanter blev screenet ved genotypebestemmelse ved hjælp af PCR forstærkning og Sanger sekventering. Grundlæggende fæotypisk karakterisering af den mandlige sterile homozygot linje blev udført ved mikroskopisk observation af ris mandlige kønsorganer, pollen levedygtighed analyse af jod kalium iodid (I2-KI) farvning semi-tynde tværsnit af udvikle anthers.

Introduction

Ris er den vigtigste fødevareafgrøde, især i udviklingslandene, og udgør en basisfødevare til over halvdelen af verdens befolkning. Samlet set vokser efterspørgslen efter riskorn og forventes at stige med 50 % i 2030 og 100 % i 20501,2. Fremtidige forbedringer i ris udbytte bliver nødt til at udnytte forskellige molekylære og genetiske ressourcer, der gør ris en glimrende model for monocotyledonous plante forskning. Disse omfatter et effektivt transformationssystem, avanceret molekylærkort og offentligt tilgængelig database over udtrykte sekvenskoder, som er blevet genereret over mangeår 3,,4. En strategi for at forbedre høstudbyttet er hybridfrøproduktion 5, et centralt element, som er evnen til at manipulere mandlige frugtbarhed. En forståelse af den molekylære kontrol af mænds frugtbarhed i kornafgrøder kan bidrage til at omsætte vigtig viden til praktiske teknikker til at forbedre produktionen af hybridfrø og øgeafgrødeproduktiviteten 6,7.

Genetisk transformation er et vigtigt redskab for grundforskning og kommercielt landbrug, da det muliggør indførelse af fremmede gener eller manipulation af endogene gener i afgrøder, og resulterer i generering af genetisk modificerede linjer. En passende transformationsprotokol kan bidrage til at fremskynde genetiske og molekylære biologiundersøgelser med henblik på grundlæggende forståelse afgenregulering 8. I bakterier, genetisk transformation finder sted naturligt; men i planter, det udføres kunstigt ved hjælp af molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie, der forårsager kronen galdesygdom i planter ved at overføre T-DNA, en region af sin Ti plasmid, i plantecellen via en type IV sekretion system11,12. I planter, A. tumefaciens-medierettransformation betragtes som en udbredt metode til gen modifikation, fordi det fører til stabil og lav kopi nummer integration af T-DNA i værten genom13. Transgene ris blev først genereret gennem Agrobacterium-medieretgen transformation i midten af 1990’erne i japonica sorten14. Ved hjælp af denne protokol blev flere transgene linjer opnået inden for en periode på 4 måneder med en transformationseffektivitet på 10-30 %. Undersøgelsen viste, at der er to kritiske skridt for en vellykket transformation: den ene er induktion af embryogene callus fra modne frø og en anden er tilsætning af acetosyringone, en phenolforbindelse, til bakteriekultur under co-dyrkning, som giver mulighed for højere transformation effektivitet iplanterne 14,,15. Denne protokol er blevet flittigt anvendt med mindre ændringer i japonica16,17,18,19 samt andre sorter såsom indica20,21,22,23 og tropiske japonica24,25. Faktisk over 80% af de artikler, der beskriver ris transformation bruge Agrobacterium-medieretgen transformation som et værktøj13. Til dato er der udviklet flere genetiske transformationsprotokoller ved hjælp af risfrø som udgangsmateriale til kalustiluktion16,17,18,19. Men meget lidt er kendt om unge blomsterstand som explants for callus produktion. Samlet set er det vigtigt at etablere en hurtig, reproducerbar og effektiv gentransformings- og regenereringsprotokol for funktionel genomforskning og undersøgelser af afgrødeforbedring.

I de senere år har udviklingen af CRISPR-Cas9-teknologien resulteret i en præcis genomredigeringsmekanisme til at forstå genfunktionen og levere agronomisk vigtige forbedringer tilplanteavl 26,27. CRISPR giver også et betydeligt løfte om manipulation af mandlig reproduktiv udvikling og hybridproduktion. I denne undersøgelse anvendte vi et gen knockout system ved hjælp af CRISPR-Cas9 teknologi og koblet det til en effektiv ris gen transformation protokol ved hjælp af unge blomsterstande som explants, og dermed skabe stabile mandlige sterile linjer til studiet af reproduktiv udvikling.

Protocol

1. sgRNA-CAS9 planteudtryk vektor konstruktion og Agrobacterium-medierettransformation Målret mod et sterilt hanegenOsABCG15 i ris i henhold til den offentliggjorte litteratur28. Design sgRNA for det målrettede sted placeret mellem 106-125 bp i den anden exon af OsABCG15 (Figur 1). Brug T4 polynukleotid kinase til at syntetisere sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5’TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3′ og 5’sgR-OsABCG15-R: AA…

Representative Results

Demonstreret her er brugen af genredigering teknologi til at skabe en mandlig steril linje for fremtidig forskning af Agrobacterium-medieretgenetisk transformation i ris. For at skabe den mandlige sterile linje osabcg15, CRISPR-CAS9-medieret mutagenese blev brugt til binær vektor konstruktion. SgRNA var drevet af OsU3 promotor, mens udtrykket kassette af hSpCas9 var drevet af den dobbelte 35S promotor, og den midterste vektor blev samlet i en enkelt binær vektor pCAMBIA1300 designet til A…

Discussion

Kunstige gengene mandlige sterile mutanter genereres traditionelt ved tilfældig fysisk, kemisk eller biologisk mutagenese. Selv om disse er kraftfulde teknikker, deres tilfældige karakter undlader at udnytte den enorme mængde af moderne genomisk viden, der har potentiale til at levere skræddersyede forbedringer i molekylæravl 32. CRISPR-Cas9-systemet har været meget udbredt i planter på grund af dets enkle og overkommelige midler til at manipulere og redigere DNA29<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende Xiaofei Chen for at give de unge ris blomsterstande og bistand til at gøre ris væv kultur medium. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31900611).

Materials

1-Naphthaleneacetic acid Sigma-Aldrich N0640
2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid Sigma-Aldrich D7299
6-Benzylaminopurine (6-BA) Sigma-Aldrich B3408
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Agar Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000561
Ammonium sulfate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10002918
Aneurine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Bacteriological peptone Sangon Biotech A100636
Beef extract Sangon Biotech A600114
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004808
Calcium chloride dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20011160
Casein acid hydrolysate Beijing XMJ Scientific Co., Ltd C184
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10007216
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10008218
D(+)-Glucose anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63005518
D-sorbitol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63011037
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Sigma-Aldrich E5134
EOS Digital SLR and Compact System Cameras Canon EOS 700D
Formaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010018
Fully Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Leica RM 2265
Glacial acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000208
Glycine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62011516
Hygromycin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd H370
Inositol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63007738
Iodine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011517
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012116
Kanamycine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd K378
Kinetin Sigma-Aldrich K0753
L-Arginine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004034
L-Aspartic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004736
L-Glutamine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd G229
L-proline Beijing XMJ Scientific Co., Ltd P698
Magnesium sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013018
Manganese sulfate monohydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013418
Microscopes NIKON Eclipse 80i
MS Phytotech M519
Nicotinic acid Sigma-Aldrich N0765
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016308
Potassium dihydrogen phosphate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017608
Potassium iodide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017160
Potassium nitrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6) Sigma-Aldrich 47862
Rifampicin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd R501
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019718
Sodium molybdate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019816
Stereo microscopes Leica Microsystems Leica M205 A
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10021418
Technovit embedding Kits 7100 Heraeus Teknovi, Germany 14653
Timentin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd T869
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Leica HI1210
Yeast extract Sangon Biotech A515245
Zinc sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10024018
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
  2. Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
  3. Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
  4. Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
  5. Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
  6. Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
  7. Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
  8. Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
  9. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  10. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
  11. Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
  12. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
  13. Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
  14. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
  15. Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
  16. Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
  17. Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
  18. Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
  19. Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
  20. Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
  21. Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
  22. Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
  23. Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
  24. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  25. Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
  26. Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
  27. Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
  28. Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  29. Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
  30. Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
  31. Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).

Tags

Agrobacterium-mediated TransformationTransgenic ProductionRiceMale Reproductive DevelopmentYoung InflorescencesCallus ProductionGene TransformationRegenerationVideo DemonstrationMeiosis StageNBD2 MediumEB PlateYEB MediumAAM AS MediumEmbryogenic Calli
check_url/61665?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, D., Mondol, P. C., Uzair, M., Tucker, M. R., Zhang, D. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (164), e61665, doi:10.3791/61665 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image