Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso
Summary
Questo lavoro descrive l’uso della tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 per knockout gene endogeno OsABCG15 seguita da un protocollo di trasformazione mediato Agrobacterium modificatoper produrre una linea stabile maschio-sterile nel riso.
Abstract
La sterilità maschile è un importante tratto agronomico per la produzione di semi ibridi che di solito è caratterizzata da difetti funzionali negli organi riproduttivi maschili/gameti. I recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 consentono un’elevata efficacia di editing e mutazioni di knockout per il salvataggio dei tempi di geni candidati endogeni in siti specifici. Inoltre, la trasformazione genetica mediata dall’Agrobacteriumdel riso è anche un metodo chiave per la modificazione genica, che è stato ampiamente adottato da molti laboratori pubblici e privati. In questo studio, abbiamo applicato gli strumenti di editing del genoma crispR-Cas9 e generato con successo tre linee mutanti sterili maschili dall’editing mirato del genoma di OsABCG15 in una cultivar japonica. Abbiamo utilizzato un metodo modificato di trasformazione del riso mediato da Agrobacteriumche potrebbe fornire ottimi mezzi di emasculazione genetica per la produzione ibrida di semi nel riso. Le piante transgeniche possono essere ottenute entro 2-3 mesi e i trasformatori omozigoti sono stati schermati dalla genotipazione utilizzando l’amplificazione PCR e il sequenziamento Diger. La caratterizzazione fenotipica di base della linea omozigosa sterile maschile è stata eseguita mediante l’osservazione microscopica degli organi riproduttivi maschili di riso, l’analisi della vitalità del polline mediante iodio di iodio (I2-KI) macchiando la sezione trasversale semisegnare degli anteri.
Introduction
Il riso è la più importante coltura alimentare, in particolare nei paesi in via di sviluppo, e rappresenta un alimento base per oltre la metà della popolazione mondiale. Complessivamente, la domanda di grano di riso è in crescita e si prevede un aumento del 50% entro il 2030 e del 100% entro il 20501,2. I futuri miglioramenti nella resa del riso dovranno capitalizzare su diverse risorse molecolari e genetiche che rendono il riso un modello eccellente per la ricerca sulle piante monocotyledonose. Questi includono un sistema di trasformazione efficiente, una mappa molecolare avanzata e un database accessibile al pubblico di tag di sequenza espressi, che sono stati generati nel corso dimolti anni 3,4. Una strategia per migliorare la resa delle colture è la produzione ibridadi sementi 5, un elemento centrale del quale è la capacità di manipolare la fertilità maschile. Comprendere il controllo molecolare della fertilità maschile nelle colture cerealicole può contribuire a tradurre le conoscenze chiave in tecniche pratiche per migliorare la produzione di sementi ibride e migliorare la produttivitàdelle colture 6,7.
La trasformazione genetica è uno strumento chiave per la ricerca di base e l’agricoltura commerciale in quanto consente l’introduzione di geni estranei o la manipolazione di geni endogeni nelle piante da coltura e si traduce nella generazione di linee geneticamente modificate. Un protocollo di trasformazione appropriato può contribuire ad accelerare gli studi di biologia genetica e molecolare per la comprensione fondamentale della regolazionegenica 8. Nei batteri, la trasformazione genetica avviene naturalmente; tuttavia, nelle piante, viene eseguita artificialmente utilizzando tecniche di biologia molecolare9,10. L’Agrobacterium tumefaciens è un batterio Gram-negativo trasmesso dal suolo che causa la malattia del gallo corona nelle piante trasferendo T-DNA, una regione del suo plasmide Ti, nella cellula vegetale attraverso un sistema di secrezione di tipo IV11,12. Nelle piante, la trasformazione mediata da A. tumefaciensè considerata un metodo diffuso per la modificazione genica perché porta all’integrazione stabile e a basso numero di copie del T-DNA nel genoma dell’ospite13. Il riso transgenico è stato generato per la prima volta attraverso la trasformazione genica mediata dall’Agrobacteriuma metà degli anni ’90 nella cultivar japonica14. Utilizzando questo protocollo, sono state ottenute diverse linee transgeniche in un periodo di 4 mesi con un’efficienza di trasformazione del 10%-30%. Lo studio ha indicato che ci sono due fasi critiche per la trasformazione di successo: una è l’induzione del callo embrionale da semi maturi e un’altra è l’aggiunta di acetosyringone, un composto fenolico, alla coltura batterica durante la co-coltivazione, che consente una maggiore trasformazione dell’efficienza nellepiante 14,15. Questo protocollo è stato ampiamente utilizzato con piccole modifiche in japonica16,17,18,19 così come altre cultivar come indica20,21,22,23 e tropical japonica24,25. Infatti, oltre l’80% degli articoli che descrivono la trasformazione del riso utilizzano la trasformazione genica mediata dall’Agrobacteriumcome strumento13. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli di trasformazione genetica utilizzando semi di riso come materiale di partenza per l’induzione callus16,17,18,19. Tuttavia, si sa molto poco sui giovani infiorescenza come esplicativi per la produzione di callus. Nel complesso, è importante stabilire un protocollo di trasformazione e rigenerazione genica rapido, riproducibile ed efficiente per la genomica funzionale e gli studi sul miglioramento delle colture.
Negli ultimi anni, il progresso della tecnologia CRISPR-Cas9 ha portato a un preciso meccanismo di editing del genoma per comprendere la funzione genica e fornire miglioramenti agronomiamente importanti perl’allevamento delle piante 26,27. CRISPR offre anche notevoli promesse per la manipolazione dello sviluppo riproduttivo maschile e della produzione ibrida. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema di knockout genico utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 e lo abbiamo accoppiato a un protocollo efficiente di trasformazione genica del riso utilizzando le giovani infiorescenze come espiantamenti, creando così linee sterili maschili stabili per lo studio dello sviluppo riproduttivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I mutanti sterili maschili artificiali sono tradizionalmente generati da mutagenesi fisica, chimica o biologica casuale. Anche se si tratta di tecniche potenti, la loro natura casuale non riesce a capitalizzare la grande quantità di conoscenze genomiche moderne che ha il potenziale per fornire miglioramenti su misura nell’allevamentomolecolare 32. Il sistema CRISPR-Cas9 è stato ampiamente utilizzato nelle piante grazie ai suoi mezzi semplici e convenienti per manipolare e modificare il DNA<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Xiaofei Chen per aver fornito le giovani infiorescenze di riso e l’assistenza nel rendere la coltura del tessuto di riso mezzo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
