Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе
Summary
Эта работа описывает использование технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для нокаутирования эндогенного гена OsABCG15 с последующим модифицированным протоколом трансформации Agrobacterium-опосредованногодля производства стабильной мужской стерильной линии в рисе.
Abstract
Мужская стерильность является важной агрономической чертой для производства гибридных семян, которая обычно характеризуется функциональными дефектами в мужских репродуктивных органах/геймерах. Последние достижения в области технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 позволяют обеспечить высокую эффективность редактирования и временем для мутаций эндогенных генов-кандидатов на конкретных участках. Кроме того, Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация риса также является ключевым методом модификации генов, который был широко принят многими государственными и частными лабораториями. В этом исследовании мы применили инструменты редактирования генома CRISPR-Cas9 и успешно создали три мужские стерильные линии мутантов путем целевого редактирования генома OsABCG15 в japonica cultivar. Мы использовали модифицированный метод преобразования риса при посредничестве Agrobacterium,который мог бы обеспечить отличные средства генетической выхолощения для производства гибридных семян риса. Трансгенные растения могут быть получены в течение 2-3 месяцев и гомозиготные трансформанты были проверены генотипированием с использованием усиления ПЦР и секвенирования Sanger. Базовая фенотипическая характеристика мужской стерильной гомозиготной линии была выполнена микроскопическим наблюдением за рисовыми мужскими репродуктивными органами, анализом жизнеспособности пыльцы йодным йодом калия (I2-KI),окрашивая полутонкое поперечное сечение развивающихся пыль.
Introduction
Рис является наиболее важной продовольственной культурой, особенно в развивающихся странах, и представляет собой основной продукт питания для более чем половины населения мира. В целом спрос на рисовое зерно растет и, по прогнозируется, увеличится на 50% к 2030 году и на 100% к 2050году 1,,2. Будущие улучшения урожайности риса должны будут извлечь выгоду из различных молекулярных и генетических ресурсов, которые делают рис отличной моделью для монокотайледонных исследований растений. К ним относятся эффективная система трансформации, передовая молекулярная карта и общедоступная база данных тегов выраженной последовательности, которые были созданыв течение многих лет 3,4. Одной из стратегий повышения урожайности является гибридноепроизводство семян 5,центральным элементом которого является способность манипулировать мужской плодовитости. Понимание молекулярного контроля мужской плодовитости зерновых культур может помочь перевести ключевые знания в практические методы для улучшения производства гибридных семян и повышенияурожайности 6,,7.
Генетическая трансформация является ключевым инструментом для фундаментальных исследований и коммерческого сельского хозяйства, поскольку она позволяет внедрение иностранных генов или манипуляции эндогенных генов в растениеводствах, и приводит к генерации генетически модифицированных линий. Соответствующий протокол преобразования может помочь ускорить генетические и молекулярные исследования биологии для фундаментального понимания регуляциигенов 8. У бактерий генетическая трансформация происходит естественным путем; однако, в растениях, это выполняется искусственно с использованием методов молекулярнойбиологии 9,10. Agrobacterium tumefaciens является почвенной, грам-негативной бактерией, которая вызывает заболевания коронного желчного пузыря у растений, передавая T-DNA, область его плазмида Ti, в клетку растений через систему секреции типа IV11,12. В растениях, A. tumefaciens-опосредованное преобразование считается широко распространенным методом для модификации генов, поскольку это приводит к стабильной и низкой интеграции числа копий Т-ДНКв геном хозяина 13. Трансгенный рис был впервые создан через Agrobacterium-опосредованноепреобразование гена в середине 1990-х годов в japonica cultivar14. С помощью этого протокола в течение 4 месяцев было получено несколько трансгенных линий с эффективностью трансформации от 10%до 30%. Исследование показало, что есть два критических шага для успешной трансформации: один является индукция эмбрионального каллуса из зрелых семян, а другой является добавление ацетосиренгона, фенольное соединение, к бактериальной культуре во время совместного выращивания, что позволяет более высокую эффективность преобразованияв растениях 14,15. Этот протокол был широко использован с незначительными изменениями в japonica16,17,18,19, а также другие сорта, такие как indica20,21,22,23 и тропические japonica24,,25. Действительно, более 80% статей, описывающих преобразование риса использовать Agrobacterium-опосредованноепреобразование генов в качестве инструмента13. На сегодняшний день разработано несколько протоколов генетической трансформации с использованием семян риса в качестве исходного материаладля индукции каллуса 16,,17,,18,,19. Тем не менее, очень мало известно о молодых соцветий, как explants для производства каллуса. В целом, важно создать быстрый, воспроизводимый и эффективный протокол преобразования генов и регенерации для функциональной геномики и исследований по улучшению урожая.
В последние годы развитие технологии CRISPR-Cas9 привело к точному механизму редактирования генома, чтобы понять функцию генов и доставить агрономически важные улучшениядля разведения растений 26,27. CRISPR также предлагает значительные перспективы для манипулирования мужским репродуктивным развитием и гибридным производством. В этом исследовании мы использовали систему генного нокаута с использованием технологии CRISPR-Cas9 и соединили ее с эффективным протоколом преобразования генов риса, используя молодые соцветия в качестве эксплантов, создавая тем самым стабильные мужские стерильные линии для изучения репродуктивного развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Искусственные генные мужские стерильные мутанты традиционно генерируются случайным физическим, химическим или биологическим мутагенезом. Хотя это мощные методы, их случайный характер не может извлечь выгоду из огромного количества современных геномных знаний, которые имеют потенци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Xiaofei Чэнь для предоставления молодых соцветий риса и помощь в создании рисовой ткани культуры среды. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
