Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz
Summary
Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.
Abstract
La esterilidad masculina es un rasgo agronómico importante para la producción de semillas híbridas que generalmente se caracteriza por defectos funcionales en órganos reproductores/gametos masculinos. Los avances recientes en la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 permiten una alta eficacia de edición y mutaciones eliminatorias de los genes candidatos endógenos en sitios específicos. Además, la transformación genética mediada por Agrobacteriumdel arroz es también un método clave para la modificación de genes, que ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios públicos y privados. En este estudio, aplicamos las herramientas de edición del genoma CRISPR-Cas9 y generamos con éxito tres líneas mutantes estériles masculinas mediante la edición específica del genoma de OsABCG15 en un cultivar de japonica. Utilizamos un método modificado de transformación de arroz mediado por Agrobacteriumque podría proporcionar excelentes medios de emasculación genética para la producción de semillas híbridas en el arroz. Las plantas transgénicas se pueden obtener en un plazo de 2 a 3 meses y los transformantes homocigotos se examinaron mediante el genotipado mediante amplificación de PCR y secuenciación de Sanger. La caracterización fenotípica básica de la línea homocigota estéril masculina se realizó mediante observación microscópica de los órganos reproductores masculinos de arroz, análisis de viabilidad del polen por yoduro de potasio yodo (I2-KI)tinción semi-delgada sección transversal de los anteras en desarrollo.
Introduction
El arroz es el cultivo alimentario más importante, particularmente en los países en desarrollo, y representa un alimento básico para más de la mitad de la población mundial. En general, la demanda de grano de arroz está creciendo y se prevé que aumente un 50% para 2030 y un 100% para 20501,2. Las futuras mejoras en el rendimiento del arroz tendrán que capitalizar diversos recursos moleculares y genéticos que hacen del arroz un modelo excelente para la investigación monocoqueledonosa de las plantas. Estos incluyen un sistema de transformación eficiente, mapa molecular avanzado y base de datos accesible al público de etiquetas de secuencia expresadas, que se han generado a lo largo de muchos años3,,4. Una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos es la producción de semillas híbridas5,cuyo elemento central es la capacidad de manipular la fertilidad masculina. Comprender el control molecular de la fertilidad masculina en los cultivos de cereales puede ayudar a traducir los conocimientos clave en técnicas prácticas para mejorar la producción de semillas híbridas y mejorar la productividad de los cultivos6,,7.
La transformación genética es una herramienta clave para la investigación básica y la agricultura comercial, ya que permite la introducción de genes extraños o la manipulación de genes endógenos en las plantas de cultivo, y resulta en la generación de líneas modificadas genéticamente. Un protocolo de transformación adecuado puede ayudar a acelerar los estudios de biología genética y molecular para la comprensión fundamental de la regulación genética8. En las bacterias, la transformación genética tiene lugar de forma natural; sin embargo, en las plantas, se realiza artificialmente utilizando técnicas de biología molecular9,,10. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram-negativa transmitida por el suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas mediante la transferencia de ADN-T, una región de su plásmido Ti, a la célula vegetal a través de un sistema de secreción tipo IV11,12. En las plantas, la transformación mediada por A. tumefaciensse considera un método generalizado para la modificación del gen, ya que conduce a la integración estable y bajo del número de copia del ADN-T en el genoma del huésped13. El arroz transgénico se generó por primera vez a través de la transformación genética mediada por Agrobacteriuma mediados de la década de 1990 en el cultivarjaponica 14. Usando este protocolo, se obtuvieron varias líneas transgénicas en un período de 4 meses con una eficiencia de transformación del 10%-30%. El estudio indicó que hay dos pasos críticos para la transformación exitosa: uno es la inducción del callo embrionario a partir de semillas maduras y otro es la adición de acetosyringona, un compuesto fenólico, al cultivo bacteriano durante el cultivo, que permite una mayor eficiencia de transformación en plantas14,,15. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado con alteraciones menores en japonica16,17,18,19 así como otros cultivares como indica20,,21,22,23 y tropical japonica24,25. De hecho, más del 80% de los artículos que describen la transformación del arroz utilizan la transformación genética mediada por Agrobacteriumcomo herramienta13. Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de transformación genética utilizando semillas de arroz como material de partida para la inducción de callos16,17,18,19. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la inflorescencia joven como explantas para la producción de callos. En general, es importante establecer un protocolo rápido, reproducible y eficiente de transformación y regeneración genética para la genómica funcional y estudios sobre la mejora de los cultivos.
En los últimos años, el avance de la tecnología CRISPR-Cas9 ha dado lugar a un mecanismo preciso de edición del genoma para comprender la función génica y ofrecer mejoras agronómicamente importantes para la cría de plantas26,,27. CRISPR también ofrece una considerable promesa para la manipulación del desarrollo reproductivo masculino y la producción híbrida. En este estudio, utilizamos un sistema de eliminación de genes utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y lo acoplamos a un protocolo eficiente de transformación del gen del arroz utilizando inflorescencias jóvenes como explantas, creando así líneas estériles masculinas estables para el estudio del desarrollo reproductivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los mutantes estériles masculinos artificiales son generados tradicionalmente por mutagénesis física, química o biológica aleatoria. Aunque se trata de técnicas poderosas, su naturaleza aleatoria no capitaliza la gran cantidad de conocimiento genómico moderno que tiene el potencial de ofrecer mejoras personalizadas en la cría molecular32. El sistema CRISPR-Cas9 ha sido ampliamente utilizado en plantas debido a sus medios simples y asequibles para manipular y editar ADN29,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a Xiaofei Chen por proporcionar las inflorescencias de arroz joven y la asistencia en la elaboración del medio de cultivo del tejido de arroz. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
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