एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता आनुवंशिक परिवर्तन, ट्रांसजेनिक उत्पादन, और चावल में पुरुष प्रजनन विकास के अध्ययन के लिए इसका आवेदन
Summary
यह काम CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन करने के लिए नॉकआउट अंतर्जात जीन OsABCG15 के बाद एक संशोधित Agrobacterium-मध्यस्थतापरिवर्तन प्रोटोकॉल के लिए चावल में एक स्थिर पुरुष बाँझ लाइन का उत्पादन ।
Abstract
पुरुष बंध्यता हाइब्रिड बीज उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण कृषि लक्षण है जो आमतौर पर पुरुष प्रजनन अंगों/गेमेस में कार्यात्मक दोषों की विशेषता है । CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में हाल ही में प्रगति विशिष्ट स्थलों पर अंतर्जात उम्मीदवार जीन के उच्च संपादन प्रभावकारिता और टाइम्सविंग नॉकआउट म्यूटेशन के लिए अनुमति देती है। इसके अतिरिक्त, चावल का एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताआनुवंशिक परिवर्तन भी जीन संशोधन के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है, जिसे कई सार्वजनिक और निजी प्रयोगशालाओं द्वारा व्यापक रूप से अपनाया गया है। इस अध्ययन में, हमने CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन उपकरण लागू किए और एक जैपोनिका कल्टिवर में ओसाबीसीजी15 के लक्षित जीनोम संपादन द्वारा तीन पुरुष बाँझ उत्परिवर्ती लाइनों को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया। हमने एक संशोधित एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताचावल परिवर्तन विधि का उपयोग किया जो चावल में हाइब्रिड बीज उत्पादन के लिए आनुवंशिक विकृति के उत्कृष्ट साधन प्रदान कर सकता है। ट्रांसजेनिक पौधों को 2-3 महीने के भीतर प्राप्त किया जा सकता है और पीसीआर प्रवर्धन और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके जीनोटाइपिंग द्वारा होमोज़िगस ट्रांसफॉर्मेंट की जांच की गई। पुरुष बाँझ होमोज़िगस लाइन का मूल फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन चावल पुरुष प्रजनन अंगों के सूक्ष्म अवलोकन द्वारा किया गया था, आयोडीन पोटेशियम आयोडाइड(आई-के) द्वारा पराग व्यवहार्यता विश्लेषण।
Introduction
चावल सबसे महत्वपूर्ण खाद्य फसल है, विशेष रूप से विकासशील देशों में, और दुनिया की आबादी के आधे से अधिक के लिए एक मुख्य भोजन का प्रतिनिधित्व करता है । कुल मिलाकर चावल के दाने की मांग बढ़ रही है और 2030 तक 50 प्रतिशत और 2050 तक 100 प्रतिशत वृद्धि होने का अनुमान1,है. चावल की उपज में भविष्य में सुधार के लिए विविध आणविक और आनुवंशिक संसाधनों है कि चावल मोनोकॉयलेडोनस संयंत्र अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाने पर भुनाने की आवश्यकता होगी । इनमें एक कुशल परिवर्तन प्रणाली, उन्नत आणविक मानचित्र और व्यक्त अनुक्रम टैग का सार्वजनिक रूप से सुलभ डाटाबेस शामिल है, जो कई वर्षों में उत्पन्न किया गया है3,,4. फसल उपज में सुधार करने के लिए एक रणनीति हाइब्रिड बीज उत्पादन5है, जिसका एक केंद्रीय तत्व पुरुष प्रजनन क्षमता में हेरफेर करने की क्षमता है। अनाज फसलों में पुरुष उर्वरता के आणविक नियंत्रण को समझने से हाइब्रिड बीज उत्पादन में सुधार और फसल उत्पादकता6,7में वृद्धि करने के लिए महत्वपूर्ण ज्ञान को व्यावहारिक तकनीकों में तब्दील करने में मदद मिल सकती है ।
आनुवंशिक परिवर्तन बुनियादी अनुसंधान और वाणिज्यिक कृषि के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है क्योंकि यह विदेशी जीन या फसल पौधों में अंतर्जात जीन के हेरफेर की शुरूआत में सक्षम बनाता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित लाइनों के उत्पादन में परिणाम है । एक उपयुक्त परिवर्तन प्रोटोकॉल जीन नियमन8की मौलिक समझ के लिए आनुवंशिक और आणविक जीव विज्ञान अध्ययन में तेजी लाने में मदद कर सकता है । बैक्टीरिया में, आनुवंशिक परिवर्तन स्वाभाविक रूप से होता है; हालांकि, पौधों में, यह कृत्रिम रूप से आणविक जीव विज्ञानतकनीकोंका उपयोग कर किया जाता है 9,10. एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens एक मिट्टी जनित, ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो पौधों में ताज पित्त रोग का कारण बनता है टी-डीएनए, इसके टीआई प्लाज्मिड के एक क्षेत्र को टाइप IV स्राव प्रणाली11, 12,12के माध्यम से संयंत्र कोशिका में स्थानांतरित करके। पौधों में, ए tumefaciens-मध्यस्थतापरिवर्तन जीन संशोधन के लिए एक व्यापक विधि माना जाता है क्योंकि यह मेजबान जीनोम13में टी डीएनए के स्थिर और कम कॉपी संख्या एकीकरण की ओर जाता है । ट्रांसजेनिक चावल सबसे पहले 1990 के दशक के मध्य में जैपोनिका कल्टीवर14में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताजीन परिवर्तन के माध्यम से उत्पन्न हुआ था । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 10%-30% की परिवर्तन दक्षता के साथ 4 महीने की अवधि के भीतर कई ट्रांसजेनिक लाइनें प्राप्त की गई थीं। अध्ययन से संकेत मिलता है कि सफल परिवर्तन के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं: एक परिपक्व बीजों से भ्रूणजनित कॉलस का शामिल होना है और दूसरा सह-खेती के दौरान जीवाणु संस्कृति के लिए एक फेनोलिक यौगिक, एसीटोसिरिंगोन का जोड़ है, जो पौधों में उच्च परिवर्तन दक्षता के लिए अनुमति देता है14,,15। इस प्रोटोकॉल का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल जैपोनिका,2216 ,17, 18,,19के साथ – साथ इंडिका2018,21 ,22 ,23और उष्णकटिबंधीय जैपोनिका23 24,,25में मामूली परिवर्तनकेसाथ किया गया है । दरअसल, चावल परिवर्तन का वर्णन करने वाले 80% से अधिक लेख एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताजीन परिवर्तन को एक उपकरण के रूप में उपयोग करते हैं13। आज तक, चावल के बीज का उपयोग करके कॉलस प्रेरण 16 ,,,17, 18,,1819के लिए एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में कई आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं ।19 हालांकि, बहुत कम कॉलस उत्पादन के लिए एक्सप्लांट के रूप में युवा इनफ्लोरेसेंस के बारे में जाना जाता है। कुल मिलाकर, कार्यात्मक जीनोमिक्स और फसल सुधार पर अध्ययन के लिए एक तेजी से, प्रजनन योग्य और कुशल जीन परिवर्तन और पुनर्जनन प्रोटोकॉल स्थापित करना महत्वपूर्ण है।
हाल के वर्षों में, CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी की उन्नति के परिणामस्वरूप जीन समारोह को समझने और पौधों के प्रजनन के लिए कृषि विज्ञानात्मक रूप से महत्वपूर्ण सुधार देने के लिए एक सटीक जीनोम संपादन तंत्र,हुआहै।26 CRISPR भी पुरुष प्रजनन विकास और संकर उत्पादन के हेरफेर के लिए काफी वादा प्रदान करता है । इस अध्ययन में, हमने CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एक जीन नॉकआउट प्रणाली का उपयोग किया और इसे एक कुशल चावल जीन परिवर्तन प्रोटोकॉल के साथ मिलकर युवा इनफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एक्सप्लांट्स के रूप में जोड़ा, जिससे प्रजनन विकास के अध्ययन के लिए स्थिर पुरुष बाँझ लाइनें बनाई जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
कृत्रिम जेनिक पुरुष बाँझ म्यूटेंट पारंपरिक रूप से यादृच्छिक भौतिक, रासायनिक, या जैविक म्यूटेनेसिस द्वारा उत्पन्न होते हैं। यद्यपि ये शक्तिशाली तकनीकें हैं, लेकिन उनकी यादृच्छिक प्रकृति आधुनिक जीनो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को युवा चावल inflorescences और चावल के ऊतक संस्कृति माध्यम बनाने में सहायता प्रदान करने के लिए Xiaofei चेन स्वीकार करना चाहते हैं । इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31900611) ने सपोर्ट किया।
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
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