Agrobacterium-medierad genetisk omvandling, Transgen produktion, och dess tillämpning för studiet av manlig reproduktiv utveckling i Ris
Summary
Detta arbete beskriver användningen av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknik för att knockout endogena genen OsABCG15 följt av en modifierad Agrobacterium-medierad omvandling protokoll för att producera en stabil han-steril linje i ris.
Abstract
Manlig sterilitet är en viktig agronomisk drag för hybrid utsäde produktion som vanligtvis kännetecknas av funktionella defekter i manliga reproduktionsorgan / könströ. De senaste framstegen inom CRISPR-Cas9-genomredigeringsteknik möjliggör hög redigeringseffekt och tidsavvisande knockout-mutationer av endogena kandidatgener på specifika platser. Dessutom är Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling av ris också en viktig metod för genmodifiering, som har antagits i stor utsträckning av många offentliga och privata laboratorier. I denna studie, vi tillämpas CRISPR-Cas9 genomet redigeringsverktyg och framgångsrikt genererat tre manliga sterila mutant linjer genom riktade genomet redigering av OsABCG15 i en japonica sorter. Vi använde en modifierad Agrobacterium-medierad risomvandlingsmetod som kunde ge utmärkta medel för genetisk emasculation för hybridutsädeproduktion i ris. Transgena växter kan erhållas inom 2– 3 månader och homozygous transformants screenades genom genotypning med hjälp av PCR-förstärkning och Sangersekvensering. Grundläggande fenotypic karakterisering av manliga sterila homozygous linje utfördes genom mikroskopisk observation av de ris manliga reproduktiva organ, pollen viabilitet analys av jod kalium jod jod jod (jag2-KI) färgning halvtunna tvärsnitt av utveckla anthers.
Introduction
Ris är den viktigaste livsmedelsgrödor, särskilt i utvecklingsländerna, och utgör en basföda för över hälften av världens befolkning. Totalt sett växer efterfrågan på rissäd och beräknas öka med 50 % fram till 2030 och 100 % fram till 20501,2. Framtida förbättringar i ris avkastning kommer att behöva kapitalisera på olika molekylära och genetiska resurser som gör ris en utmärkt modell för monocotyledonous växtforskning. Dessa inkluderar ett effektivt omvandlingssystem, avancerad molekylär karta, och allmänt tillgänglig databas med uttryckta sekvens taggar, som har genererats under många år3,4. En strategi för att förbättra skörden är hybrid utsädeproduktion 5, en central del av som är förmågan att manipulera manlig fertilitet. Att förstå den molekylära kontrollen av manlig fertilitet i spannmålsgrödor kan bidra till att översätta viktig kunskap till praktiska tekniker för att förbättra hybridutdröproduktionen och ökagrödornasproduktivitet 6,7.
Genetisk omvandling är ett viktigt verktyg för grundforskning och kommersiellt jordbruk eftersom det möjliggör införande av främmande gener eller manipulering av endogena gener i grödor, och resulterar i generering av genetiskt modifierade linjer. Ett lämpligt omvandlingsprotokoll kan bidra till att påskynda genetiska och molekylärbiologiska studier för grundläggande förståelse av genreglering8. I bakterier sker genetisk transformation naturligt; emellertid, i växter, det utförs artificiellt med hjälp av molekylärbiologiska tekniker9,10. Agrobacterium tumefaciens är en jordburen, Gramnegativ bakterie som orsakar krongall sjukdom i växter genom att överföra T-DNA, en region av dess Ti plasmid, in i växtcellen via en typ IV utsöndring system11,12. I växter, A. tumefaciens-medierad omvandling anses vara en utbredd metod för genmodifiering eftersom det leder till stabil och låg kopia nummer integration av T-DNA i värdgenomet13. Transgena ris först genereras genom Agrobacterium-medierad gen omvandling i mitten av 1990-talet i japonica kultivar14. Med hjälp av detta protokoll erhölls flera transgena linjer inom en period på 4 månader med en omvandlingseffektivitet på 10%–30%. Studien visade att det finns två kritiska steg för den framgångsrika omvandlingen: en är induktion av embryogena callus från mogna frön och en annan är tillsats av acetosyringone, en fenolförening, till bakteriekulturen under samodling, vilket möjliggör högre omvandlingseffektivitet i växter14,15. Detta protokoll har i stor utsträckning använts med mindre ändringar i japonica16,17,18,19 samt andra sorter som indica20,21,22,23 och tropiska japonica24,25. Faktum är att över 80% av de artiklar som beskriver ris omvandling använda Agrobacterium-medierad gen omvandling som ett verktyg13. Hittills har flera genetiska transformationsprotokoll tagits fram med hjälp av risutsäde som startmaterial för kallsinnigainduktion 16,17,18,19. Dock är mycket lite känt om unga blomställning som explants för kallkutproduktion. Sammantaget är det viktigt att upprätta en snabb, reproducerbar, och effektiv gen omvandling och regenerering protokoll för funktionell genomik och studier på gröda förbättring.
Under de senaste åren har utvecklingen av CRISPR-Cas9-tekniken resulterat i en exakt genomredigeringsmekanism för att förstå genfunktionen och leverera agronomiskt viktiga förbättringar för växtförädling26,27. CRISPR ger också ett stort löfte om manipulering av manlig reproduktionsutveckling och hybridproduktion. I denna studie använde vi ett gen knockout-system med CRISPR-Cas9-teknik och kopplade det till ett effektivt testprotokoll för omvandling av risgener med hjälp av unga blomställningar som explants, vilket skapar stabila sterila manliga linjer för studier av reproduktionsutveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konstgjorda manliga sterila mutanter är traditionellt genereras av slumpmässiga fysiska, kemiska, eller biologiska mutagenes. Även om dessa är kraftfulla tekniker, misslyckas deras slumpmässiga natur att dra nytta av den stora mängden modern genomisk kunskap som har potential att leverera skräddarsydda förbättringar i molekylär avel32. CRISPR-Cas9-systemet har använts i stor utsträckning i växter på grund av dess enkla och prisvärda medel för att manipulera och redigera DNA<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Xiaofei Chen för att ge unga ris blomställningar och hjälp med att göra risvävnad kultur medium. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
