Summary
यहां, हम Caenorhabditis elegans भ्रूण को तैयार करने और बढ़ते करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, 4 डी माइक्रोस्कोप के तहत विकास को रिकॉर्ड करते हैं और सेल वंश का पता लगाते हैं।
Abstract
4 डी माइक्रोस्कोपी विभिन्न जानवरों में भ्रूण विकास प्रक्रिया को उजागर करने के लिए एक अमूल्य उपकरण है। पिछले दशकों में, Caenorhabditis elegans विकास का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छे मॉडल में से एक के रूप में उभरा है। ऑप्टिकल दृष्टिकोण से, इसका आकार और पारदर्शी शरीर इस नेमाटोड को डीआईसी (डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट या नोमार्स्की) माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श नमूना बनाता है। यह लेख सी एलिगन्स नेमाटोड को बढ़ाने, उनके भ्रूण को तैयार करने और बढ़ाने, 4 डी माइक्रोस्कोपी और सेल वंश ट्रेसिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है। विधि नोमार्स्की छवियों के मल्टीफोकल टाइम-लैप्स रिकॉर्ड और विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण पर आधारित है। यह तकनीक सेलुलर स्तर पर भ्रूण विकासात्मक गतिशीलता का खुलासा करती है। उत्परिवर्ती में किसी भी भ्रूण दोष, जैसे कि स्पिंडल अभिविन्यास, सेल माइग्रेशन, एपोप्टोसिस या सेल भाग्य विनिर्देश में समस्याएं, कुशलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है और स्कोर किया जा सकता है। भ्रूण की लगभग हर एक कोशिका का पालन उस क्षण तक किया जा सकता है जब भ्रूण स्थानांतरित होना शुरू हो जाता है। 4 डी डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा सी एलिगन्स भ्रूण के पूर्ण सेल वंश का पता लगाना श्रमसाध्य है, लेकिन विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग इस कार्य को बहुत सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, इस तकनीक को प्रयोगशाला में लागू करना आसान है। 4 डी माइक्रोस्कोपी एक बहुमुखी उपकरण है और भ्रूण के विकास का एक अद्वितीय विश्लेषण करने की संभावना को खोलता है।
Introduction
4 डी माइक्रोस्कोपी एक मल्टीफोकल टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग सिस्टम है जो शोधकर्ताओं को स्थानिक रूप से और समय के साथ जैविक नमूने की सेल गतिशीलता को पंजीकृत करने और मापने की अनुमति देता है। सेल संस्कृतियों, खमीर या जीवित ऊतकों को 4 डी विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है लेकिन यह तकनीक विशेष रूप से जीवित भ्रूण के विकास का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है। इस विश्लेषण का संकल्प भ्रूण की हर एक कोशिका के स्तर तक पहुंचता है। प्रत्येक सेल विभाजन का पता लगाया जा सकता है, और समय के साथ सेल आंदोलनों का पता लगाया जा सकता है। कोशिकाओं के भाग्य का मूल्यांकन उस स्थिति और आकार के अनुसार किया जाता है जो कोशिकाएं प्राप्त करती हैं। नोमार्स्की ऑप्टिक्स का उपयोग ऑर्थोगोनल रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश बीम का उपयोग करके बिना दाग वाले पारदर्शी नमूनों के विपरीत को बढ़ाता है जो फोकल प्लेन में हस्तक्षेप करते हैं। परिणामी छवियां तीन आयामी दिखाई देती हैं, जो एक तरफ प्रकाशित होती हैं।
नाभिक का स्वत: पता लगाने और सेल वंशों के उत्पादन के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और जीएफपी ट्रांसजेनिक जानवरों के उपयोग पर आधारित अन्य तरीकों कोविकसित किया गया है। उन प्रणालियों का लाभ स्पष्ट है: सॉफ़्टवेयर समय की अवधि में प्रत्येक नाभिक को मैन्युअल रूप से चिह्नित करने की आवश्यकता को बहुत अधिक ओवरराइड करता है (हालांकि देर से चरणों के दौरान कुछ मैनुअल पर्यवेक्षण की आवश्यकता होती है)। हालांकि, सेल आकार या झिल्ली गतिशीलता में परिवर्तन से जुड़ी सेलुलर प्रक्रियाएं, जैसे कि सेल भेदभाव, प्रवासन, एपोप्टोसिस या लाश निगलने के दौरान होने वाली प्रक्रियाएं, फ्लोरोसेंट-लेबल वाली नाभिक छवियों में एक काली पृष्ठभूमि के रूप में छिपी रहती हैं।
इसके विपरीत, 4 डी नोमार्स्की माइक्रोस्कोपी (जिसे डीआईसी माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी भी कहा जाता है) नाभिक और सेल आकार दोनों परिवर्तनों को दिखाता है जो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती जानवरों के विकास के दौरान होते हैं। यह मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल वंश ट्रेसिंग की अनुमति देता है, केवल संचारित प्रकाश को नियोजित करता है। विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाने के अलावा ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करने की कोई सामान्य आवश्यकता नहीं है, जिस मामले में फ्लोरोसेंट स्कैन को इंटरकैलेटेड किया जा सकता है। इसलिए, यह गतिशील सेल प्रक्रियाओं जैसे भ्रूणजनन या एपोप्टोसिस पर काम करने वाली कई प्रयोगशालाओं के लिए इष्टतम दृष्टिकोण हो सकता है जिसे डीआईसी माइक्रोस्कोपी 3,4,5,6,7 के तहत हाइलाइट किया जा सकता है।
कई लचीले और उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यक्रम माइक्रोस्कोपिक छवियों को कैप्चर करने और रिकॉर्ड किए गए नमूने में सेल वंश, 3 डी मॉडल, सेल माइग्रेशन पथ, आदि के पुनर्निर्माण के लिए उपलब्ध हैं। एक मानक प्रयोग में, छवियों को फोकल विमानों की एक श्रृंखला में अधिग्रहित किया जाता है, एक स्थिर दूरी पर, जिसकी संख्या नमूना मोटाई पर निर्भर करती है। विश्लेषण के अस्थायी संकल्प स्कैन आवृत्ति में वृद्धि के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है। कंप्यूटर भंडारण क्षमता के अलावा रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए वस्तुतः कोई सीमा नहीं है। उदाहरण के लिए, C. elegans भ्रूण विकास विश्लेषण के लिए, हम नियमित रूप से 30 फोकल विमानों (1 माइक्रोन-चरण प्रत्येक) पर छवियों को प्राप्त करते हैं, 12 घंटे के लिए हर 30 सेकंड में।
इन प्रणालियों को कई जानवरों के भ्रूण के विश्लेषण पर लागू किया गया है जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगन्स 8,9,10, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर11, अन्य नेमाटोड भ्रूण12,13, टार्डीग्रेड14,15 और यहां तक कि शुरुआती माउस भ्रूण16। एकमात्र आवश्यकता माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड तैयारी पर विकसित करने में सक्षम एक पारदर्शी भ्रूण होना है।
संक्षेप में, डीआईसी आधारित 4 डी माइक्रोस्कोपी 1) छोटे, पारदर्शी जानवरों के भ्रूण विकास का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है: सेल वंश, सेल माइग्रेशन पथों का पता लगाना, 3 डी मॉडल उत्पन्न करना, आदि; 2) जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करना; 3) सेल संस्कृति गतिशीलता का अध्ययन, खमीर से मानव कोशिकाओं के लिए; 4) ऊतक गतिशीलता या भ्रूण के टुकड़ों का विश्लेषण; 5) कोशिका मृत्यु कैनेटीक्स और लाश निगलने की मात्रा; और 6) भ्रूण विकास ता्मक विशेषताओं के आधार पर तुलनात्मक फाइलोजेनी विश्लेषण करना। यदि इनमें से किसी भी विषय (या समान वाले) में रुचि है, तो 4 डी माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
1. बढ़ो सी Petri व्यंजन पर elegans
- NGM प्लेटें तैयार करें और उन्हें खाद्य स्रोत (चित्रा 1) के रूप में ई कोलाई OP50 के साथ बीज दें। बढ़ो और सी elegans बनाए रखने के रूप मेंवर्णित 17. एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बीज प्लेटों को स्टोर करें।
- कीड़े जोड़ने से पहले प्लेटों को वांछित तापमान पर समायोजित करें।
- कीड़े को स्थानांतरित करने के लिए, एक पुरानी प्लेट से आगर का एक हिस्सा निकालें और इसे एक ताजा प्लेट पर रखें।
- वैकल्पिक रूप से, एक बाँझ कृमि पिकर के साथ एकल जानवरों को कैप्चर करें (एक चपटी नोक के साथ 32-गेज प्लैटिनम तार का एक 1 इंच का टुकड़ा, एक पाश्चर पिपेट की नोक पर घुड़सवार) और उन्हें नई प्लेट पर रखें।
- वांछित तापमान पर कीड़े उगाएं।
- 20 डिग्री सेल्सियस, मानक तापमान पर सी elegans कीड़े बढ़ो। हालांकि, थर्मो-संवेदनशील म्यूटेंट के विकास का विश्लेषण करने के लिए, रात भर इनक्यूबेशन प्रदर्शन करें, आमतौर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर। विशिष्ट उत्परिवर्ती के आधार पर आवश्यकतानुसार इस इनक्यूबेशन की अवधि और तापमान को समायोजित करें।
2. भ्रूण बढ़ते से पहले 4 डी माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग तैयार (चित्रा 2)
- भ्रूण तैयार करने से पहले माइक्रोस्कोप और तापमान नियंत्रण सेट करें। C. elegans भ्रूण बहुत जल्दी विभाजित करते हैं। भ्रूण को माउंट करने के तुरंत बाद रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए तैयार रहें।
- रिकॉर्डिंग तापमान को या तो 15 डिग्री सेल्सियस, 20 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें।
- नियमित रूप से 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रिकॉर्ड करें। अपने फेनोटाइप को दिखाने के लिए प्रतिबंधात्मक तापमान पर थर्मो-संवेदनशील म्यूटेंट रिकॉर्ड करें। उत्परिवर्ती के रूप में एक ही तापमान पर एक डब्ल्यूटी नियंत्रण रिकॉर्ड करें (यदि एक अलग तैयारी में किया जाता है)।
नोट: डब्ल्यूटी भ्रूण 25 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से विकसित होते हैं और सेल वंश में अतिरिक्त अंतर के बिना 15 डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से विकसित होते हैं। एक तापमान-नियंत्रित कमरे में माइक्रोस्कोप रखें। स्लाइड को ठंडा या गर्म करके अतिरिक्त नियंत्रण अत्यधिक वांछनीय है। यह माइक्रोस्कोप उद्देश्य और संघनित्र के चारों ओर एक धातु की अंगूठी के माध्यम से एक विशिष्ट तापमान पर पानी को प्रसारित करके प्राप्त किया जा सकता है। उद्देश्य और तैयारी विसर्जन तेल के माध्यम से सीधे संपर्क में हैं और तापमान हस्तांतरण कुशल है। यह प्रणाली रिकॉर्डिंग तापमान के सटीक नियंत्रण और भ्रूण के विकास के दौरान तापमान बदलाव करने की अनुमति देती है।
- नियमित रूप से 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रिकॉर्ड करें। अपने फेनोटाइप को दिखाने के लिए प्रतिबंधात्मक तापमान पर थर्मो-संवेदनशील म्यूटेंट रिकॉर्ड करें। उत्परिवर्ती के रूप में एक ही तापमान पर एक डब्ल्यूटी नियंत्रण रिकॉर्ड करें (यदि एक अलग तैयारी में किया जाता है)।
- माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर में रिकॉर्ड पैरामीटर निर्धारित करें.
- एक मानक C. elegans रिकॉर्डिंग (फ्लोरोसेंट स्कैन के बिना) के लिए, का चयन करें:
30 फोकल विमानों के z-स्टैक, प्रत्येक 1 माइक्रोन की दूरी पर।
प्रत्येक z-स्टैक की शुरुआत के बीच 30 सेकंड के अंतराल।
1500 z-स्टैक (रिकॉर्ड के 12.5 घंटे)।
नोट:: दोनों वाणिज्यिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खुला स्रोत माइक्रोस्कोप नियंत्रण प्रोग्राम छवियों को कैप्चर करने के लिए इस वर्कफ़्लो को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अब माइक्रोस्कोप रिकॉर्ड करने के लिए तैयार है।
- एक मानक C. elegans रिकॉर्डिंग (फ्लोरोसेंट स्कैन के बिना) के लिए, का चयन करें:
3. तैयार करें और भ्रूण माउंट
- एक अच्छी छवि प्राप्त करने में पहले कदम के रूप में एक पतली, सजातीय अगर पैड तैयार करें (चित्रा 3)।
- विआयनीकृत पानी में 4.5% आगर समाधान के 50 मिलीलीटर तैयार करें। माइक्रोवेव में उबलने के लिए गर्मी और 3 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों में 0.5 - 1 मिलीलीटर डालें।
- desication से बचने के लिए मोम फिल्म के साथ ध्यान से ट्यूबों को सील करें। सील बंद आगर ट्यूबों को दो महीने तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- लैब बेंच पर, 80 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक है:
शुद्ध पेट्रोलियम जेली (पिघला हुआ) की एक परखनली, अंदर एक ठीक पेंट ब्रश के साथ।
आसुत जल के साथ एक परखनली जिसमें पाश्चर पिपेट होता है.
नोट: यह सुनिश्चित करता है कि सभी आवश्यक सामग्री गर्म हो जाएगी, और अगर पैड बनाने की प्रक्रिया में ठोस नहीं होगा। - अगर ट्यूबों में से एक के शीर्ष से मोम फिल्म को हटा दें, और आगर को पिघलाने के लिए सावधानीपूर्वक इसे अल्कोहल बर्नर पर गर्म करें। सावधानी बरतें क्योंकि ग्लास ट्यूब से निष्कासित गर्म आगर जलने का कारण बन सकता है।
- अगर के पिघलने के बाद, आगर को तरल रूप में रखने के लिए ट्यूब को गर्मी ब्लॉक में रखें।
- वैकल्पिक रूप से, आगर ट्यूबों को एक बर्नर का उपयोग किए बिना उन्हें पिघलाने के लिए प्रयोग से पहले गर्मी ब्लॉक 1h में रखें। पिघले हुए अगर को एक दिन के बाद छोड़ दिया जाना चाहिए।
- प्लास्टिक के एक टुकड़े पर दो अन्य लोगों के बीच एक माइक्रोस्कोप स्लाइड (स्लाइड ए) रखें।
- एक और स्लाइड (स्लाइड बी) लें और इसे एक हाथ में अपनी उंगलियों से पकड़ें।
- दूसरी ओर, गर्म पाश्चर पिपेट का उपयोग करके स्लाइड ए के केंद्र में पिघले हुए आगर की एक छोटी सी बूंद रखें।
- स्लाइड A और B के बीच एक बहुत ही पतला पैड बनाने के लिए तुरंत अगर ड्रॉप पर स्लाइड B दबाएँ. चरण 3.2.3 तक इन स्लाइड्स को एक साथ सैंडविच रखें.
- भ्रूण माउंट करें।
- पिकर के साथ 5-10 गुरुत्वाकर्षण hermaphrodites ले लीजिए और उन्हें पानी से भरे एक वॉचमेकर ग्लास में रखें।
- हर्माफ्रोडाइट नेमाटोड को खोलने और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत गर्भाशय से शुरुआती अंडे (1-4 कोशिकाओं) को निकालने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
- चरण 3.1.10 से स्लाइड ले लो और स्लाइड A पर आगर पैड को बेनकाब करने के लिए स्लाइड B को धीरे से स्लिप करें।
- एक केशिका ट्यूब के साथ pipetting द्वारा आगर पैड के केंद्र में एक प्रारंभिक अंडे जगह.
- वैकल्पिक रूप से, आगर पैड पर भ्रूण का एक सेट युक्त एक बूंद पिपेट करें और फिर प्रारंभिक चरण के भ्रूण की खोज करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इस चरण को करें।
- यदि आवश्यक हो, तो अंडे को टूथपिक के अंत में चिपके हुए एक बरौनी के साथ झुकाकर स्थानांतरित करें।
- केशिका पिपेट के साथ अतिरिक्त पानी निकालें।
नोट: एक केशिका पिपेट आसानी से एक अल्कोहल बर्नर पर एक पाश्चर पिपेट को गर्म करके और इसे दोनों सिरों से खींचकर तैयार किया जा सकता है। - सावधानी से एक coverslip के साथ तैयारी को कवर. हवा के बुलबुले से बचने के लिए, स्लाइड पर कवरस्लिप के एक किनारे को रखें और धीरे-धीरे आसन्न किनारे के साथ एक स्केलपेल को स्लाइड करें और तैयारी पर कवरस्लिप को तिरछे ढंग से लपेटें।
- पानी के साथ आगर पैड के आसपास की जगह के 3/4 को भरने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। 1/4 जगह को हवा के साथ छोड़ दें।
- लंबी रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान desication से बचने के लिए पेट्रोलियम जेली के साथ coverslip सील.
- कवरस्लिप के किनारे के चारों ओर पिघले हुए पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत का विस्तार करने के लिए ठीक ब्रश का उपयोग करें।
नोट: अब तैयारी रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है।
4. डीआईसी समायोजित करें और 4 डी माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग शुरू
- स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। कम आवर्धन उद्देश्य (5x या 10x) का उपयोग करके भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करें।
- 100x विसर्जन उद्देश्य के लिए बदलें।
- एक Nomarski छवि प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल घटकों को समायोजित करें।
- संघनित्र पर ध्यान केंद्रित करें।
- कंडेनसर के एपर्चर को पूरी तरह से खोलें और फ़ील्ड डायाफ्राम को बंद करें (यह एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर प्रदान करेगा और इसलिए, अधिक रिज़ॉल्यूशन)।
- जांचें कि माइक्रोस्कोप पर दोनों ध्रुवीकरण अधिकतम प्रकाश विलुप्त होने का कारण बनने के लिए उन्मुख हैं।
- भ्रूण की एक अच्छी तीन आयामी छवि प्राप्त करने के लिए वोलास्टन प्रिज्म को चालू करें, एक तरफ प्रकाशित। भ्रूण को दूसरी तरफ प्रकाशित करने के प्रभाव को प्राप्त करने के लिए प्रिज्म को दूसरी दिशा में घुमाएं।
नोट:: इन चरणों को रिकॉर्डिंग से पहले एक परीक्षण नमूने पर किया जा सकता है ताकि विश्लेषण किए जा रहे नमूने पर केवल ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता हो।
- माइक्रोस्कोप में छवि कैप्चर लॉन्च करें।
5. 4 डी-फिल्म का विश्लेषण करें (चित्रा 4).
नोट:: रिकॉर्डिंग के पूरा हो जाने के बाद, सेल वंश का पुनर्निर्माण और विश्लेषण करने के लिए सेल वंश ट्रेसिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
सेल वंश अनुरेखण सॉफ्टवेयर कोशिका संस्कृतियों या ऊतक टुकड़ों में भ्रूण विकास या गतिशीलता के विस्तृत विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कार्यक्रम नमूने की सेलुलर गतिशीलता पर कई डेटा सेटों को निकालता है और मात्रा निर्धारित करता है जिसमें प्रत्येक रिकॉर्ड किए गए सेल के पूर्ण सेल वंश की पीढ़ी शामिल है, जिसमें सेल डिवीजन, सेल चक्र की लंबाई, माइग्रेशन या एपोप्टोसिस के साथ-साथ इसके कैनेटीक्स भी शामिल हैं। इसके अलावा, सेल भेदभाव को सेल के रूपात्मक परिवर्तनों या विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा स्कोर किया जा सकता है। मूल रूप से, सॉफ़्टवेयर स्क्रीन दो खिड़कियों को प्रदर्शित करती है: बाईं विंडो पर, 4 डी फिल्म को आगे और पीछे या ऊपर या नीचे के स्तर तक खेला जा सकता है ताकि प्रत्येक सेल को रिकॉर्डिंग के दौरान समय और स्थान में पालन किया जा सके। सही विधवा पर, सेल वंश उत्पन्न होता है। 4 डी फिल्म में एक सेल नाभिक पर क्लिक करने से वंश विंडो में एक बिंदु उत्पन्न होता है जो सेल नाम, भाग्य और स्थानिक निर्देशांक की जानकारी को संग्रहीत करता है। एक विशिष्ट सेल का सेल वंश 4 डी फिल्म को आगे बढ़ाकर और समय के साथ उस विशिष्ट सेल के माइटोसिस को चिह्नित करने के लिए नाभिक पर समय-समय पर क्लिक करके उत्पन्न होता है। रिकॉर्ड की गई कोशिकाओं में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया की पुनरावृत्ति भ्रूण या नमूने के पूर्ण सेल वंश को उत्पन्न करती है। प्रत्येक सेल के स्थानिक निर्देशांक के लिए संग्रहीत जानकारी का उपयोग बाद में 3 डी भ्रूण मॉडल और सेल माइग्रेशन पथों के पुनर्निर्माण के लिए किया जाता है।
- वंश ट्रेसिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और ऊपरी बार मेनू पर जाकर और चयन करके एक नई परियोजना बनाएं:
फ़ाइल | नई परियोजना। - रिकॉर्डिंग तापमान के आधार पर सेल वंश टेम्पलेट का चयन करें: 25 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग के लिए DB08, 20 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग के लिए DB10 और 15 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग के लिए DB12।
- उभरती हुई विंडो में रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेट करें: स्कैन गिनती (आमतौर पर 1500), स्कैन (30 सेकंड), स्तर गणना (30) और स्तरों (1 माइक्रोन) के बीच की दूरी के बीच का समय।
- छवि फ़ाइल और स्वरूप का चयन करें.
- उस छवि निर्देशिका का चयन करें जहाँ छवियाँ सहेजी गई थीं.
- चुनें कि छवियों को एकल छवियों (स्तर और समय के प्रति एक छवि) के रूप में या बहु-छवि z-स्टैक के रूप में सहेजा जाना चाहिए या नहीं।
- फ़ाइल नामकरण और छवि स्वरूप निर्धारित करें. नियमित रूप से, एकल छवियों को निम्न नामों के अंतर्गत सहेजा जाता है:
X0000L00C1 (स्कैन 0, स्तर 0, चैनल 1 के लिए)
X0000L01C1 (स्कैन 0, स्तर 1, चैनल 1 के लिए)
X0000L02C1 (स्कैन 0, स्तर 2, चैनल 1 के लिए)
...
X0001L00C1 (स्कैन 1, स्तर 0, चैनल 1 के लिए)
X0001L01C1 (स्कैन 1, स्तर 1, चैनल 1 के लिए)
...
X0300L04C1 (स्कैन 300, स्तर 4, चैनल 1 के लिए)
...
नोट:: छवियों को संपीड़ित स्वरूप में सहेजना आपकी हार्ड डिस्क पर स्थान बचाता है.
- प्रकाश चैनलों को परिभाषित करें: डीआईसी ऑप्टिक्स के लिए 1, जीएफपी के लिए 2, आरएफपी के लिए 3, आदि। उन लोगों को जोड़ें जो 4 डी-रिकॉर्डिंग में उपयोग किए गए थे। उन्हें पता लगाने के लिए "चैनल प्रोसेसिंग सक्षम" पर क्लिक करें।
- भ्रूण के सेल वंश का पता लगाना शुरू करें। स्क्रीन में अब दो प्रमुख खिड़कियां हैं: वीडियो विंडो और सेल वंश विंडो।
- वंश विंडो पर, एक वंश शाखा का चयन करें और वीडियो विंडो पर इस सेल के अनुरूप सेल नाभिक को क्लिक करने के लिए माउस का उपयोग करें।
- कर्सर कुंजियों का उपयोग करके 4D-मूवी को आगे, पीछे, या ऊपर या नीचे एक स्तर पर चलाकर स्थानिक रूप से और समय के साथ सेल का पालन करें।
- समय-समय पर सेल नाभिक पर क्लिक करें। यह वंश शाखा में एक बिंदु उत्पन्न करता है और इस समय सेल के स्थानिक निर्देशांक को पंजीकृत करता है। नतीजतन, सेल वंश प्रगति करता है, और भ्रूण के 3 डी पुनर्निर्माण संभव हैं।
- वापसी कुंजी पर क्लिक करके माइटोसिस चिह्नित करें. फिर बेटी कोशिकाओं में से एक का चयन करें और पहले की तरह इसका पालन करें।
- प्रक्रिया को दोहराएं (चरण 5.6.1 से 5.6.4) भ्रूण कोशिकाओं के बाकी हिस्सों के लिए पूर्ण सेल वंश का पता लगाने के लिए, या एपोप्टोसिस से गुजरने वाले लोगों जैसे ब्याज की विशिष्ट कोशिकाओं का पालन करने के लिए।
- रूढ़िवादी डब्ल्यूटी सी elegans सेल वंश के साथ उत्परिवर्ती वंश की तुलना करें।
Representative Results
जीन जीएसआर -1 के लिए एक सी एलिगेंस उत्परिवर्ती के भ्रूण विकास को चिह्नित करने के लिए, जो एंजाइम ग्लूटाथियोन रिडक्टेस को एन्कोड करता है, जो कम ग्लूटाथियोन (जीएसएच) को पुनर्जीवित करने के लिए आवश्यक है और नेमाटोड में रेडॉक्स होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में शामिल है, हमने जीएसआर -1 (टीएम 3574) विलोपन उत्परिवर्ती की 4 डी माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया जो एक प्रारंभिक भ्रूण गिरफ्तारी फेनोटाइप18 का कारण बनता है। दोनों WT और संतुलित gsr-1 (tm3574) उत्परिवर्ती C. elegans सूत्रकृमि NGM प्लेटों पर उगाए गए थे जो खाद्य स्रोत17 के रूप में ई कोलाई OP50 के साथ बीजित थे। जीएसआर -1 (टीएम 3574) कीड़े को दो पीढ़ियों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर विषमयुग्मजी के रूप में उगाया गया था और फिर होमोजीगस कीड़े (जो मातृ भार के लिए वयस्कता के लिए धन्यवाद तक बढ़ने में सक्षम हैं) को भ्रूण विश्लेषण से पहले एक रात भर के इनक्यूबेशन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित कर दिया गया था। संक्षेपण से बचने के लिए कार्डबोर्ड बक्से के भीतर वर्म प्लेटों को इनक्यूबेट किया गया था (चित्रा 1)। ग्रैविड नेमाटोड को युवा भ्रूण निकालने के लिए खुला काट दिया गया था।
समान परिस्थितियों में उत्परिवर्ती बनाम रूढ़िवादी डब्ल्यूटी के भ्रूण विकास की तुलना करने के लिए, एक डब्ल्यूटी (नियंत्रण के रूप में) और एक जीएसआर -1 (टीएम 3574) भ्रूण को एक दूसरे के बगल में एक ही तैयारी पर रखा गया था। 4 डी माइक्रोस्कोपी वर्कफ़्लो एक मानक motorized सीधा माइक्रोस्कोप डीआईसी प्रकाशिकी के साथ outfitted पर चलाया गया था. माइक्रोस्कोप नियंत्रण कार्यक्रम पर चयनित रिकॉर्डिंग पैरामीटर थे: 1 माइक्रोन दूरी पर 30 फोकल विमानों के जेड-स्टैक प्रत्येक, प्रत्येक जेड-स्टैक की शुरुआत के बीच 30 सेकंड के अंतराल और 1500 जेड-स्टैक (रिकॉर्डिंग के 12.5 घंटे)। रिकॉर्डिंग तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस (कमरे में और माइक्रोस्कोप चरण दोनों में) में समायोजित किया गया था (चित्रा 2)।
एक बार रिकॉर्डिंग पूरी हो जाने के बाद, छवियों की फ़ाइल को खोला गया था, और वीडियो विंडो (चित्रा 4) में दिखाए गए सेल नाभिक पर क्लिक करके वंश अनुरेखण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सेल वंश का पुनर्निर्माण किया गया था। ट्रेस किए गए जीएसआर -1 (टीएम 3574) उत्परिवर्ती भ्रूण सेल वंश की तुलना पृष्ठभूमि में दर्शाए गए सी एलिगन्स डब्ल्यूटी वंश के साथ की गई थी। एक प्रमुख परिणाम भ्रूण के विकास के दौरान कोशिका चक्र की एक प्रगतिशील देरी का पता लगाना था। नतीजतन, उत्परिवर्ती भ्रूण को मध्यवर्ती चरणों में गिरफ्तार किया गया जबकि डब्ल्यूटी भ्रूण ने प्रगति की और अंत में लार्वा के रूप में हैच किया।
माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की तैयारी और प्रत्यक्ष अवलोकन या देर से भ्रूण मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग डब्ल्यूटी की तुलना में उत्परिवर्ती में युवा भ्रूण के उच्च प्रतिशत की उपस्थिति को प्रकट कर सकता है। भ्रूण की गिरफ्तारी को तब सबसे प्रशंसनीय स्पष्टीकरण के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है। हालांकि, सेल चक्र देरी का प्रत्यक्ष प्रमाण और सटीक परिमाणीकरण केवल सुरुचिपूर्ण और आसानी से दिखाया जा सकता है और 4 डी माइक्रोस्कोपी प्रयोग के माध्यम से परिमाणित किया जा सकता है। भ्रूण विकास की अन्य महत्वपूर्ण विशेषताएं जैसे सेल भेदभाव या एपोप्टोसिस (चित्रा 5) को 4 डी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गतिशील तरीके से भी देखा जा सकता है जो एक ही प्रयोग में विकास के कई पहलुओं का विस्तृत विश्लेषण प्रदान करता है।
चित्रा 1: C. elegans नेमाटोड प्रयोगशाला की स्थिति में बढ़ रहा है। नेमाटोड ई कोलाई-सीडेड एनजीएम प्लेटों पर उगाए जाते हैं, कार्डबोर्ड बक्से में संग्रहीत होते हैं और 15 डिग्री सेल्सियस, 20 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: 4 डी माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट. दो अलग-अलग माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (ए और बी) का उदाहरण। ये प्रोग्राम 4 डी माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग के दौरान माइक्रोस्कोप और छवि कैप्चरिंग को नियंत्रित करने के लिए वर्कफ़्लो बनाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: आगर पैड की तैयारी और सी elegans भ्रूण दिखा के बढ़ते के सीरियल तस्वीरें. A. तैयार आगर ट्यूब. बी-सी। आगर पैड की तैयारी। डी। आंशिक रूप से पानी से भरा स्लाइड। ई। पेट्रोलियम जेली के साथ स्लाइड सील. एफ। अंतिम तैयारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: सेल वंश अनुरेखक सॉफ्टवेयर के सीरियल स्क्रीन शॉट्स. कार्यक्रम एक सेल चक्र देरी उत्परिवर्ती (बाएं) और एक डब्ल्यूटी (दाएं) सी एलिगन्स भ्रूण के भ्रूण सेल वंश के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। एक। विकास का प्रारंभिक चरण। बी-सी। दोनों भ्रूणों का विकास समय के साथ आगे बढ़ता है। डी डब्ल्यूटी भ्रूण ठीक से विकसित होता है और बढ़ाव शुरू कर देता है जबकि उत्परिवर्ती गिरफ्तार करता है। सभी मामलों में प्रोग्राम वीडियो विंडो और वंश विंडो प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एक C. elegans WT भ्रूण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं की मसूर अपवर्तन आकार. रूपात्मक विशेषताओं द्वारा परिभाषित सेल भाग्य का मूल्यांकन 4 डी माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। छवि सेम चरण में एक सी elegans भ्रूण से पता चलता है. जीवित कोशिकाएं एक दानेदार साइटोप्लाज्म से घिरे चिकनी आकार के नाभिक दिखाती हैं। इसके विपरीत, एपोप्टोटिक कोशिकाएं (पीले तीर) संघनित होती हैं और एक दाल जैसी, अपवर्तित आकार को अपनाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
आधुनिक जीव विज्ञान में प्रमुख चुनौतियों में से एक बहुकोशिकीय जीवों के विकास को समझना है। C. elegans विकासशील भ्रूण में सेल प्रसार और सेल भेदभाव के बीच ठीक समन्वय का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल में से एक के रूप में उभरा है। ऑप्टिकल दृष्टिकोण से, इसका पारदर्शी शरीर और इसका छोटा आकार इस सूत्रकृमि को डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श नमूना बनाता है। इसी तरह की विशेषताओं वाले अन्य जीवों को भी 4 डी माइक्रोस्कोपी विश्लेषण 11,12,13,14,15,16 के अधीन किया गया है।
उन विकासात्मक अध्ययनों के लिए, या तो आगे या रिवर्स आनुवांशिकी द्वारा जीन निष्क्रियता भ्रूणजनन में इसकी भागीदारी के लिए एक सुराग प्रदान करती है। एक बार जब एक जीन विकास में भूमिका निभाने के लिए साबित हो जाता है, तो अगला कदम सही शरीर योजना की स्थापना में अपनी सटीक भूमिका को परिभाषित करना है। Immunostaining अधिकांश मॉडलों के लिए चयनित दृष्टिकोण है। यह तकनीक सेल भेदभाव या विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में समस्याओं को स्पष्ट करती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा यह है कि यह केवल विकास में एक निश्चित बिंदु पर एक या अधिक मार्करों की अभिव्यक्ति का एक स्थिर दृश्य प्रदान करता है। विकास के दौरान इन मार्करों का एक गतिशील दृश्य केवल अलग-अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न भ्रूणों को धुंधला करके प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के निश्चित नमूनों में सेल वंश पुनर्निर्माण संभव नहीं है।
4 डी माइक्रोस्कोपी भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है। यह तकनीक एक सेल स्तर के संकल्प पर विकास गतिशीलता का खुलासा करती है। भ्रूण में कोई भी दोष जैसे कि स्पिंडल अभिविन्यास, सेल माइग्रेशन, एपोप्टोसिस, सेल भाग्य विनिर्देश, आदि में समस्याएं एक 4 डी फिल्म में दिखाई देंगी जिसे शोधकर्ता द्वारा आगे और पीछे की ओर देखा जा सकता है, मात्रा और स्कोर किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, भ्रूण में लगभग प्रत्येक कोशिका का पालन उस क्षण तक किया जा सकता है जब भ्रूण स्थानांतरित होना शुरू हो जाता है। भ्रूण केवल दृश्य प्रकाश और नोमार्स्की ऑप्टिक्स के साथ 4 डी माइक्रोस्कोपी के अधीन होते हैं, जो फोटोडैमेज का सामना नहीं करते हैं। फ्लोरोसेंट स्कैन को रिकॉर्डिंग के भीतर भी इंटरकैलेटेड किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि जीन कब और कहां व्यक्त किया जाता है। भ्रूण जो महत्वपूर्ण फोटोडैमेज से पीड़ित होते हैं, उन्हें सेल चक्र विस्तार द्वारा पहचाना जाता है जो एक मानक डब्ल्यूटी वंश भ्रूण की तुलना में मजबूत यूवी विकिरण का कारण बनता है। उस मामले में, फोटोडैमेज को यूवी लैंप तीव्रता को कम करके और कैमरे की संवेदनशीलता या एक्सपोजर समय को बढ़ाकर कम किया जा सकता है। रूपात्मक विशेषताएं और आणविक मार्कर किसी भी उत्परिवर्ती के भ्रूण विकास को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं।
एक 4 डी माइक्रोस्कोपी प्रणाली की स्थापना प्रयोगशाला में लागू करना आसान है और, कुछ अभ्यास के बाद, सेल गतिशीलता और सेल संस्कृतियों के वंश अनुरेखण और माइक्रोस्कोप क्षेत्र में प्रत्येक सेल के संकल्प स्तर पर पारदर्शी नमूनों को जीवित करने का एक बेजोड़ विश्लेषण सक्षम बनाता है। डीआईसी छवियों पर सेल वंश अनुरेखण अभी भी हाथ से संसाधित किया जाता है। यह समय लेने वाला है और, हालांकि सॉफ़्टवेयर वंश त्रुटियों का पता लगाता है जैसे कि एक ही सेल को चिह्नित करने वाली विभिन्न वंश शाखाएं, गलतियां संभव हैं। जबकि जीएफपी-लेबल कोशिकाओं का स्वचालित पता लगाना अच्छी तरह से विकसित किया गया है2, अचिह्नित कोशिकाओं और दृश्यमान प्रकाश छवियों के आधार पर पूरक वंश अनुरेखण सॉफ्टवेयर अभी भी प्रारंभिक चरण में है और पूर्ण भ्रूण विश्लेषण के लिए वास्तव में उपयोगी नहीं है। किसी भी संदेह के बिना, दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में छवि पहचान प्रणालियों का आवेदन इस क्षेत्र में एक महान प्रगति लाएगा।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक Rioja Salud फाउंडेशन (Fondos FEDER) और स्पेनिश Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं। Cristina Romero Aranda AECC (Asociación Española Contra el Cáncer) से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
References
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120 (2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
