Stamcellebasert terapi har dukket opp som en effektiv strategi for å reparere skadet hjertevev etter hjerteinfarkt. Vi tilbyr en optimal in vivo søknad for stamcelletransplantasjon ved hjelp av gelatin hydrogels som er i stand til å være enzymatisk krysskoblet.
En av de store problemene overfor dagens hjerte stamcellebehandling for å forebygge postinfarkt hjertesvikt er lav retensjon og overlevelse av transplanterte celler i det skadede myokardiet, som begrenser deres terapeutiske effekt. Nylig har bruken av stillasbiomaterialer fått oppmerksomhet for å forbedre og maksimere stamcellebehandling. Målet med denne protokollen er å innføre en enkel og grei teknikk for å transplantere benmargsavledede mesenchymale stamceller (MSCer) ved hjelp av injiserbare hydroksyfenylpropionsyre (GH) hydrogeler; hydrogelene er gunstige som en celleleveringsplattform for hjertevevsteknikk på grunn av deres evne til å være krysskoblet in situ og høy biokompatibilitet. Vi presenterer en enkel metode for å fremstille MSC-lasting GH hydrogels (MSC / hydrogels) og evaluere deres overlevelse og spredning i tredimensjonal (3D) in vitro kultur. I tillegg demonstrerer vi en teknikk for intramyokarial transplantasjon av MSC/hydrogeler hos mus, som beskriver en kirurgisk prosedyre for å indusere hjerteinfarkt (MI) via venstre fremre synkende (LAD) koronar ligation og påfølgende MSC / hydrogels transplantasjon.
Hjertestamcelleterapi har dukket opp som en potensiell tilnærming for hjerteinfarkt reparasjon og regenerering1,2. Til tross for de siste positive resultatene i dyremodeller og kliniske studier, er anvendelsen av stamcellebasert terapi for hjerteinfarkt reparasjon begrenset på grunn av lav oppbevaring og dårlig overlevelse av injiserte celler ved det infarcted hjertevev3,4. Som et resultat har bruk av cellebasert vevsteknikk, inkludert injiserbarebiomaterialer 5,hjertepatcher6og celleark7,blitt intensivt studert for å forbedre celleretensjon og integrering i verts myokardiet.
Blant de ulike potensielle tilnærmingene til bioingeniør hjertevev reparasjon, injiserbare hydrogeler kombinert med passende celletyper, for eksempel mesenchymal stamceller (MSCs), embryonale stamceller (ESCer), og indusert pluripotente stamceller (iPSCs), er et attraktivt alternativ for effektivt å levere celler i hjerteinfarktregioner 8,9. Gelatin, en velkjent naturlig polymer, kan brukes som en injiserbar matrise på grunn av sin store biokompatibilitet, betydelig biologisk nedbrytbarhet og redusert immunogenitet sammenlignet med et bredt spekter av biomaterialer som brukes i biomedisinske applikasjoner. Selv om gelatinbaserte injiserbare plattformer har stort potensial, forblir deres anvendelighet in vivo begrenset basert på deres lave mekaniske stivhet og enkel nedbrytbarhet i det fysiologiske miljøet.
For å overvinne disse begrensningene, har en roman og enkel design av gelatinbaserte hydrogeler bestående av hydroksyfenylpropionsyre blitt foreslått for in vivo-applikasjoner. Gelatin-hydroksyfenylpropionsyre (GH) konjugater kan kryss-koblet in situ i nærvær av et enzym, pepperrot peroxidase (HRP), og deretter innkapsle ulike legemidler, biomolekyler, eller celler i hydrogel, noe som tyder på stort potensial i vev engineering applikasjoner10,11,12,13,14. I tillegg har vi nylig undersøkt de terapeutiske effektene av GH hydrogels som inneholder innkapslede MSCer og demonstrert deres bruk i vellykket hjertereparasjon og regenerering etter MI i en murine modell15. I denne protokollen beskriver vi en enkel teknikk for innkapsling og in vitro tredimensjonal (3D) spredning av MSCer innen GH hydrogels. Vi introduserer også en kirurgisk prosedyre designet for å generere en murine MI-modell via koronarligation og intramyokarial transplantasjon av MSC-lasting GH hydrogels inn i det infarcted hjertet.
Injiserbare GH hydrogeler har stort potensial for in vivo applikasjoner på grunn av deres evne til å homogent innlemme ulike terapeutiske midler in situ. Videre kan deres fysiske og biokjemiske egenskaper enkelt manipuleres basert på sykdomsavhengige krav. I denne forbindelse har injiserbare hydrogeler blitt foreslått for å løse de viktigste begrensningene i gjeldende hjertestamcellebehandling hemmet av dårlig overlevelse og celleretensjon (det vil si < 10% innen 24 timer etter transplantasjon) i det skadede hjert…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen støttes av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet (NRF-2018R1D1A1A02049346)
4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
DPBS | Gibco | 14040-133 | |
Dual-syringe | |||
EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
Forcep | HEBU | HB0458 | |
Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
Iodine | Green Pharmaceutical | ||
LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
Slide scanner | Leica | SCN400 | |
Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |