פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .
Abstract
איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים. כל פעילות תאית מהתפשטות תאים ואפופטוזיס, התפתחות והזדקנות, לפלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות קושרו עם קולטני ריאנודין (RyRs). למרות החשיבות של איתות סידן, המנגנון המדויק של תפקידו בהתפתחות מוקדמת אינו ברור. כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקר ההפצה והלוקליזציה של חלבונים הקשורים CICR והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול מעשי המגביר באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ושיטות פירוט עבור היסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה in-situ . שיטת ציפוי החלקת הג’לטין של אלום כרום ושיטת טרום ההטבעה של העובר מגדילה באופן דרמטי את התשואה בחקר חלבון העובר של דרוזופילה וביטוי RNA. כדי להדגים גישה זו, חקרנו DmFKBP12 / Calstabin, רגולטור ידוע של RyR במהלך התפתחות עוברית מוקדמת של Drosophila melanogaster. זיהינו את DmFKBP12 כבר בשלב blastoderm הסינכיטיאלי ולדווח על דפוס הביטוי הדינמי של DmFKBP12 במהלך הפיתוח: בתחילה כחלבון מבוזר באופן שווה ב blastoderm סינסיטיאלי, ולאחר מכן לוקליזציה מראש לשכבת המרתף של קליפת המוח במהלך blastoderm הסלולר, לפני הפצה בארכיטקטורה העצבית והעיכול הפרימיטיבית במהלך שלב שלוש אבני חן בשלב גסטרולציה מוקדמת. התפלגות זו עשויה להסביר את התפקיד הקריטי ש-RyR ממלא במערכות האיברים החיוניות שמקורן בשכבות אלה: הגנגליון התת-ושט והסופר-ושט, מערכת העצבים הגחונית ומערכת השלד והשרירים.
Introduction
איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, כגון שרירי שלד/חלק ותפקוד כלי הדם הלבביים, התפשטות התאים ואפופטוזיס, פיתוח, הזדקנות, פלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות1,2,3,4,5,6 . קולטני ריאנודין (RyRs) ואינוזיטול 1,4,5-קולטני טריספוספט (IP3Rs) הם שחקנים מרכזיים במסלול איתות הסידן הנשלט על ידי הרגולטורים שלהם חלבון קינאז A (PKA), Ca2 +/calmodulin תלוי חלבון קינאז II (CaMKII), חלבונים מחייבים FK506 (FKBPs), קלסקסטרין (CSQ), טריאדין, ו junctin1,2,3,4,5,6 . ביטוי אנושי חריג ומוטציות בחלבונים אלה יכולים להוביל לפיזיולוגיה פתולוגית כגון הפרעות קצב7 והתפשטות אונקוגנית8,9.
FKBPs לווסת את שחרור הסידן מן הרשתית אנדופלסמית (ER) על ידי RyRs. תהליך זה חיוני למנגנון ההתכווצות, ולכן אחראי לכל תנועה מכנית שנוצרת על ידי התכווצות מיוזין-אקטין באמצעות שחרור סידן המושרה בסידן יחד עם RyRs עוברי 1,2. במודלים של עכבר, היעדר RyR2 והרגולטור שלו FKBP12/Calstabin הוא תמיד קטלני, בין אם במהלך התפתחות עוברית או בתקופה שלאחר הלידה המוקדמת10,11,12. עכברי נוקאאוט FKBP12/Calstabin מציגים מומים לבביים קריטיים עם צימוד עירור-התכווצות לא סדיר (EC) ובצקת מוחית במהלך התפתחות עוברית. זה מצביע על כך FKBP12/Calstabin ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי ערוץ RyR2, אשר חשוב הן להתפתחות הלב והן להתפתחות המוחית10.
ניצוצות סידן שנערכו על ידי RyR התגלו בתחילה בשלב היווצרות הזיגוטה של ביצי מדאקה מופרות13,14. עם זאת, חקירות מעטות בוצעו על הפונקציה של איתות סידן בהתפתחות עוברית מוקדמת. ב Drosophila melanogaster, תוצאות שהתקבלו DmFKBP12 S107 מוטציות לספק ראיות חזקות התומכות בחשיבות של גן זה להתפתחות זחל ותוחלת חיים בריאה, אשר מיוחס לתפקודו נגד סטרס חמצוני 15,16. לאחרונה, זיהינו את הלוקליזציה הדינמית של חלבון FKBP12 / Calstabin ו- RNA שליח במהלך פיתוח מלנוגסטר דרוזופילה מוקדם17. באמצעות הגישות המתוארות במתודולוגיה זו, הצלחנו לעקוב אחר הביטוי של FKBP12 / Calstabin ב D. melanogaster במהלך blastoderm סינסיטיאלי (0-2 שעות), blastoderm הסלולר (2-3 שעות), gastrula מוקדם (3-12 שעות) ו gastrula מאוחר (12-24 שעות). במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקולים המפורטים של כל גישה במחקר הקודם, כולל הטמעה טרום-עוברית עבור חתך פרפין קלאסי, טיפול שקופיות טרום ציפוי עבור חלקים עובריים, היסטו-כימיה כתמים וחיסון, ו הכלאה mRNA in-situ לזיהוי ביטוי גנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRs ו- IP3Rs מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליך פיזיולוגי ופתולוגי רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד 1,2,3,4. אצל בני אדם, מוטציות נקודתיות, כגון מוטציה R4496C הקשורה ל- CPVT, בגן RyR2 מובילות לדליפת סידן מהרשת הסרקופלסמית של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (#31771377/ 31571273/31371256), תוכנית המדען המכובד הזר מהמחלקה הלאומית לחינוך (#MS2014SXSF038), הקרן הלאומית לחקר האוניברסיטאות המרכזיות של המחלקה הלאומית לחינוך (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), ו-XZ נתמכת על ידי קרן תזת הדוקטורט המצטיין (#2019TS082/2019TS079), תוכנית המפתח של מחלקת החינוך המחוזית שאאנשי (#20JS138), פרויקט הנוער של תוכנית המחקר הבסיסית למדעי הטבע של המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז שאאנשי (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
