Summary

Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Published: May 06, 2022
doi:

Summary

Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .

Abstract

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах. Каждая клеточная активность от пролиферации и апоптоза клеток, развития и старения до нейрональной синаптической пластичности и регенерации была связана с рецепторами рианодина (RyRs). Несмотря на важность передачи сигналов кальция, точный механизм его функции в раннем развитии неясен. Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации CICR-ассоциированных белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический протокол, который значительно улучшает прикрепление эмбриона дрозофилы к слайдам и детализирует методы для успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ . Метод скользящего покрытия хром-квасцового желатина и метод предварительного встраивания эмбрионов резко увеличивают выход при изучении белка эмбриона дрозофилы и экспрессии РНК. Чтобы продемонстрировать этот подход, мы изучили DmFKBP12/Calstabin, известный регулятор RyR во время раннего эмбрионального развития Drosophila melanogaster. Мы идентифицировали DmFKBP12 еще на стадии синцитиальной бластодермы и сообщили о динамическом паттерне экспрессии DmFKBP12 во время разработки: первоначально как равномерно распределенный белок в синцитиальной бластодерме, затем предварительно локализующийся в цокольном слое коры во время клеточной бластодермы, прежде чем распространяться в примитивной нейрональной архитектуре и архитектуре пищеварения во время фазы трехместного слоя в ранней гаструляции. Это распределение может объяснить решающую роль, которую RyR играет в жизненно важных системах органов, которые происходят из этих слоев: субэзофагеальный и надпищеводный ганглий, вентральная нервная система и опорно-двигательный аппарат.

Introduction

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах, таких как скелетная/гладкая мускулатура и сердечная сосудистая функция, пролиферация и апоптоз клеток, развитие, старение, нейрональная синаптическая пластичность и регенерация1,2,3,4,5,6 . Рянодиновые рецепторы (RyRs) и инозитол-1,4,5-трисфосфатные рецепторы (IP3Rs) являются основными игроками в сигнальном пути кальция, контролируемом их регуляторами протеинкиназы A (PKA), Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII), FK506 связывающих белков (FKBPs), кальциквестрина (CSQ), триадина и юнктина1,2,3,4,5,6 . Аномальная экспрессия человека и мутации в этих белках могут привести к патологической физиологии, такой как аритмии7 и онкогенная пролиферация8,9.

FKBP регулируют высвобождение кальция из эндоплазматической ретикулярной (ER) RyRs. Этот процесс необходим для механизма сокращения и, таким образом, отвечает за все механические движения, генерируемые сокращением миозина-актина посредством высвобождения кальция, вызванного кальцием, вместе с эмбриональными RyRs1,2. В мышиных моделях недостаток RyR2 и его регулятора FKBP12/Calstabin неизменно смертелен либо во время эмбрионального развития, либо в раннем постнатальном периоде10,11,12. Нокаутирующие мыши FKBP12/Calstabin демонстрируют критические пороки сердца с нерегулярной связью возбуждения-сокращения (EC) и отеком мозга во время эмбрионального развития. Это указывает на то, что FKBP12/Calstabin играет важную роль в регулировании экспрессии каналов RyR2, что важно как для сердечного, так и для мозгового развития10.

Полученные RyR искры кальция были первоначально обнаружены в фазе формирования зиготы оплодотворенных яиц медаки13,14. Тем не менее, было проведено мало исследований функции передачи сигналов кальция в раннем эмбриональном развитии. В Drosophila melanogaster результаты, полученные от мутантов DmFKBP12 S107, предоставляют убедительные доказательства, подтверждающие важность этого гена для развития личинок и здоровой продолжительности жизни, что объясняется его функцией против окислительного стресса15,16. Недавно мы выявили динамическую локализацию белка FKBP12/Calstabin и матричной РНК во время раннего развития Drosophila melanogaster17. Используя подходы, описанные в этой методологии, мы смогли отследить экспрессию FKBP12/Calstabin у D. melanogaster во время синцитиальной бластодермы (0-2 ч), клеточной бластодермы (2-3 ч), ранней гаструлы (3-12 ч) и поздней гаструлы (12-24 ч). В этой статье мы представляем подробные протоколы каждого подхода в предыдущем исследовании, включая встраивание преэмбриона для классического парафинового сечения, предварительную обработку слайдов для эмбриональных срезов, гистохимическое окрашивание и иммуноокрашивание, а также гибридизацию мРНК in-situ для идентификации экспрессии генов.

Protocol

1. Приготовление тарелок с агаром виноградного сока Добавьте 5 г агара и 5 г сахарозы в 150 мл дистиллированной воды. Кипятите его с помощью микроволновой печи до полного растворения агара и сахарозы. Смешайте 50 мл 100% виноградного сока и раствора вместе. Добавьте 1 мл 100% ?…

Representative Results

Рисунки описывают протоколы, используемые для преодоления проблемы прикрепления эмбрионов дрозофилы с высоким содержанием липидов и хитинсодержащих хорионов (таблица 1) к поверхности стеклянной горки для исследования и экспериментов. Используя метод покрытия слайдов и…

Discussion

Опосредованная кальциевыми сигналами RyRs и IP3R является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных, так и беспозвоночных животных1,2,3,4. У людей точечные мутации, такие ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (#31771377/ 31571273/31371256), Программой иностранных выдающихся ученых от Национального департамента образования (#MS2014SXSF038), Фондом исследований центральных университетов Национального департамента образования (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), а XZ поддерживается Фондом выдающихся докторских диссертаций (#2019TS082 /2019TS079), Ключевой программой Департамента образования провинции Шэньси (#20JS138), Молодежный проект Программы фундаментальных исследований в области естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (#2020JQ-885).

Materials

-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

View Video