Summary

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Published: May 06, 2022
doi:

Summary

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA’nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Abstract

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR) birçok biyolojik süreçte kritik bir rol oynar. Hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim ve yaşlanmadan nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyona kadar her hücresel aktivite Ryanodin reseptörleri (RyR) ile ilişkilendirilmiştir. Kalsiyum sinyalizasyonunun önemine rağmen, erken gelişimdeki işlevinin kesin mekanizması belirsizdir. Kısa gebelik periyoduna sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster’in embriyoları, CICR ile ilişkili proteinlerin ve bunların gelişim sırasındaki düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için birincil çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir protokol ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Krom şap jelatin slayt kaplama yöntemi ve embriyo ön gömme yöntemi, Drosophila embriyo proteini ve RNA ekspresyonunun incelenmesinde verimi önemli ölçüde artırır. Bu yaklaşımı göstermek için, Drosophila melanogaster’ın erken embriyonik gelişimi sırasında RyR’nin iyi bilinen bir düzenleyicisi olan DmFKBP12 / Calstabin’i inceledik. DmFKBP12’yi sinsityal blastoderm aşaması kadar erken bir zamanda tanımladık ve gelişim sırasında DmFKBP12’nin dinamik ekspresyon paternini bildirdik: başlangıçta sinsityal blastodermde eşit olarak dağılmış bir protein olarak, daha sonra hücresel blastoderm sırasında korteksin bodrum tabakasına önceden lokalize olarak, erken gastrülasyonda üç mücevherli tabaka fazı sırasında ilkel nöronal ve sindirim mimarisinde dağılmadan önce. Bu dağılım, RyR’nin bu katmanlardan kaynaklanan hayati organ sistemlerinde oynadığı kritik rolü açıklayabilir: subözofageal ve supraözofageal ganglion, ventral sinir sistemi ve kas-iskelet sistemi.

Introduction

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR), iskelet/düz kas ve kardiyak vasküler fonksiyon, hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim, yaşlanma, nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyon gibi birçok biyolojik süreçte kritik rol oynar1,2,3,4,5,6 . Ryanodin reseptörleri (RyR’ler) ve inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP3R), düzenleyicileri protein kinaz A (PKA), Ca2 + / kalmodüline bağımlı protein kinaz II (CaMKII), FK506 bağlayıcı proteinler (FKBP’ler), kalsequestrin (CSQ), triadin ve junktin1,2,3,4,5,6 tarafından kontrol edilen kalsiyum sinyal yolundaki önemli oyunculardır. . Anormal insan ekspresyonu ve bu proteinlerdeki mutasyonlar, aritmi7 ve onkojenik proliferasyon gibi patolojik fizyolojiye yol açabilir8,9.

FKBP’ler, RyR’ler tarafından endoplazmik retikülerden (ER) kalsiyum salınımını düzenler. Bu süreç, kasılma mekanizması için gereklidir ve bu nedenle, embriyonik RyRs1,2 ile birlikte kalsiyum kaynaklı kalsiyum salınımı yoluyla miyosin-aktin kontraksiyonu tarafından üretilen tüm mekanik hareketlerden sorumludur. Fare modellerinde, RyR2 ve regülatörü FKBP12 / Calstabin’in eksikliği, embriyonik gelişim sırasında veya erken doğum sonrası dönemde10,11,12 her zaman öldürücüdür. FKBP12 / Calstabin nakavt fareleri, embriyonik gelişim sırasında düzensiz uyarılma-kasılma kuplajları (EC) ve serebral ödem ile kritik kalp defektleri sergiler. Bu, FKBP12 / Calstabin’in hem kardiyak hem de serebral gelişim için önemli olan RyR2 kanal ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir10.

RyR tarafından yürütülen kalsiyum kıvılcımları başlangıçta döllenmiş Medaka yumurtalarının zigot oluşum aşamasında keşfedilmiştir13,14. Bununla birlikte, erken embriyonik gelişimde kalsiyum sinyalizasyonunun işlevi hakkında çok az araştırma yapılmıştır. Drosophila melanogaster’da, DmFKBP12 S107 mutantlarından elde edilen sonuçlar, bu genin larva gelişimi ve oksidatif strese karşı işlevine atfedilen sağlıklı bir yaşam süresi için önemini destekleyen güçlü kanıtlar sunmaktadır15,16. Son zamanlarda, erken Drosophila melanogaster gelişimi sırasında FKBP12 / Calstabin proteini ve mesajcı RNA’nın dinamik lokalizasyonunu tanımladık17. Bu metodolojide açıklanan yaklaşımları kullanarak, sinsityal blastoderm (0-2 saat), hücresel blastoderm (2-3 saat), erken gastrula (3-12 saat) ve geç gastrula (12-24 saat) sırasında D. melanogaster’de FKBP12 / Calstabin ekspresyonunu izleyebildik. Bu yazıda, klasik parafin kesitleme için embriyo öncesi gömme, embriyonik kesitler için ön kaplama slayt tedavisi, histo-kimya boyama ve immünoboyama ve gen ekspresyonunun tanımlanması için mRNA in-situ hibridizasyonu dahil olmak üzere önceki çalışmadaki her yaklaşımın ayrıntılı protokolleri sunulmuştur.

Protocol

1. Üzüm suyu agar tabaklarının hazırlanması 150 mL damıtılmış suya 5 g agar ve 5 g sakkaroz ekleyin. Agar ve sakkaroz tamamen çözünene kadar bir mikrodalga kullanarak kaynatın. 50 mL% 100 üzüm suyu ve çözeltiyi birlikte karıştırın. Son konsantrasyonu% 0.5 propiyonik aside yapmak için 1 mL% 100 propiyonik asit ekleyin. Hazırlanan çözeltinin 25 mL’sini her plakaya dökün. Agar katılaştıktan sonra, ortamı 4 ° C’de saklayın. <p class="jove_title"…

Representative Results

Şekiller, yüksek lipid ve kitin içeren koryon Drosophila embriyolarının (Tablo 1) inceleme ve deney için cam slayt yüzeyine bağlanma zorluğunun üstesinden gelmek için kullanılan protokolleri açıklamaktadır. Şekil 1’de gösterilen krom şap jelatin slayt kaplama yöntemini kullanarak, Drosophila embriyolarının slaytların yüzeyine bağlanmasını arttırırken, Şekil 2’de gösterilen embriyo ön gömme yönte…

Discussion

RyRs ve IP3Rs aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur1,2,3,4. İnsanlarda, RyR2 genindeki CPVT ile ilişkili R4496C mutasyonu gibi nokta mutasyonları, kardiyomiyositin sarkoplazmik retikulumundan kalsiyum sızıntısına yol açarak kardiyak disfonksiyona neden olur. Bu mutasyonlar, fiziksel akt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (#31771377 / 31571273 / 31371256), Ulusal Eğitim Bakanlığı’ndan Yabancı Seçkin Bilim İnsanı Programı (#MS2014SXSF038), Ulusal Eğitim Bakanlığı Merkez Üniversiteleri Araştırma Fonu (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) tarafından desteklenmiştir ve XZ, Shaanxi İl Eğitim Departmanının Anahtar Programı (#2019TS082 / 2019TS079), Üstün Doktora Tezi Fonu (#20JS138 / 2019TS079) tarafından desteklenmektedir. Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı Gençlik Projesi (#2020JQ-885).

Materials

-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

View Video